O uso de<em> Ex Vivo</em> Imagem de órgãos inteiros e Histologia Tissue quantitativa para determinar o Bio-distribuição das moléculas fluorescente etiquetado
Summary
Ex vivo de imagens de órgãos todo é um método rápido para a determinação das concentrações relativas dos compostos marcados com fluorescência no interior e entre os tecidos ou os grupos de tratamento. Por outro lado, a histologia quantitativa de fluorescência, enquanto que mais trabalho intensivo, permite a quantificação dos níveis absolutos de tecido de moléculas marcadas.
Abstract
Rotulagem fluorescente é um processo bem estabelecido para examinar o destino de moléculas marcadas sob uma variedade de condições experimentais in vitro e in vivo. As sondas fluorescentes são particularmente úteis para determinar a biodistribuição das moléculas grandes administradas, em que a adição de um marcador fluorescente de pequena molécula não é susceptível de afectar a cinética ou bio-distribuição do composto. Uma variedade de métodos existentes para analisar bio-distribuição que variam de forma significativa na quantidade de esforço necessária e se as medições resultantes são completamente quantitativa, mas usando vários métodos de conjugação pode proporcionar um sistema rápido e eficiente para a análise bio-distribuição.
Ex vivo de imagens de órgãos todo é um método que pode ser utilizado para comparar rapidamente as concentrações relativas das moléculas fluorescentes dentro de tecidos bem como entre vários tipos de tecidos ou os grupos de tratamento. Usando um plat de imagemformulário concebido para live-animal ou de imagem de órgão inteiro, fluorescência dentro de tecidos intactos pode ser determinada sem processamento adicional, economizando tempo e trabalho ao fornecer uma imagem precisa da bio-distribuição geral. Este processo é ideal em experiências de tentativa de determinar a especificidade de tecido ou de um composto de comparação de vários compostos diferentes. histologia do tecido quantitativa por outro lado, requer processamento adicional extensa de tecidos, a fim de criar uma medida quantitativa dos compostos marcados. Para avaliar com precisão bio-distribuição, todos os tecidos de interesse deve ser cortado, digitalizado e analisado em relação a curvas padrão, a fim de fazer comparações entre os tecidos ou grupos. histologia tecido quantitativa é o padrão ouro para determinar as concentrações de compostos absolutos dentro dos tecidos.
Aqui, nós descrevemos como ambos os métodos podem ser utilizados em conjunto de forma eficaz de avaliar a capacidade de diferentes métodos de administração, umaND modificações compostos alvo e entregam moléculas marcadas com fluorescência para o sistema nervoso central 1.
Introduction
rotulagem fluorescente é um método eficaz e facilmente utilizado para a determinação do bio-distribuição de compostos, utilizando uma gama de equipamento que é comum para muitos laboratórios. Os fluoróforos estão amplamente disponíveis, relativamente barato, e vem em uma variedade de comprimentos de onda, de tal forma que várias moléculas rotulados podem ser utilizados simultaneamente sem interferência. A maioria dos fluoróforos tem uma gama de produtos químicos para a conjugação com diferentes grupos reactivos em compostos alvo, e o processo de conjugação é geralmente simples para a maioria dos tipos de locais reactivos. Além disso, o equipamento necessário para as medições de compostos marcados com fluorescência são comuns em muitos laboratórios. microscópios fluorescentes, geradores de imagens, e scanners de slides podem ser usados em circunstâncias diferentes, tornando o uso de marcação fluorescente altamente acessível. Os marcadores fluorescentes são frequentemente utilizados para determinar a biodistribuição e a cinética de compostos tanto in vivo como ex vivo com dispositivos de imagens ao vivo, como o IVIS Spectrum Imager, e por histologia tecido quantitativa 2,3.
O uso de ex vivo de imagem de órgão inteiro usando dispositivos de geração de imagens ao vivo tem aumentado ao longo do tempo devido à sua facilidade de uso e capacidade de criar rapidamente uma comparação precisa das concentrações relativas de compostos marcados sem exigir que o tratamento posterior de tissues4. No entanto, enquanto ex vivo de imagens de órgãos conjunto pode permitir a fácil análise e comparação, não se gera uma medida quantitativa das concentrações de compostos dentro de um tecido absolutos. Isto é devido aos efeitos de dispersão de luz dentro de órgãos intactos. Desde que a dispersão de luz (e, em menor grau, absorvância) varia de acordo com o tamanho e densidade dos tecidos, imagiologia de órgãos todo pode subestimar níveis de tecido em órgãos grandes ou densos. Formulação de normas adequadas para medições de concentração absoluta também é difícil porque é preciso imitar a espessurae a densidade de cada órgão individual. Por outro lado, a imagem de órgão inteiro é um método rápido de obtenção dos níveis teciduais relativas de um agente, e que é ideal para comparar a bio-distribuição relativa de várias moléculas relacionadas (por exemplo, em estudos de selecção de medicamentos). Uma estratégia alternativa é utilizar histologia fluorescência quantitativa, uma técnica derivada a partir do método de autoradiografia quantitativa, para se obter os níveis absolutos de tecido de um agente de teste 5,6. Ao invés de colocar um animal ou órgão inteiro em um dispositivo de imaginação, a histologia do tecido quantitativa exige que cada tecido ser cortado, montadas em lâminas, digitalizados e analisados individualmente. Padrões de o agente de teste são preparadas e cortadas com a mesma espessura como as amostras de órgãos. Ao cortar todos os órgãos e as normas para a mesma espessura, a variabilidade devido à dispersão da luz ou absorvância é eliminada, e a intensidade de fluorescência do tecido pode ser apto para a curva padrão para determinar concent absolutaração. Enquanto este método, quando feito corretamente, é quantitativa, mas também é trabalho intensivo e facilmente mal utilizado. Dada a natureza mais complexa da histologia quantitativa e significativamente maior custo do trabalho, quando comparado à imagem do órgão inteiro, torna-se útil analisar em que cada processo é mais prático para usar quando se examina o bio-distribuição de compostos marcados com fluorescência. Este protocolo fornece uma descrição detalhada de como estes métodos podem ser usados em conjunto para comparar de forma eficiente a bio-distribuição do marcada com rodamina elastina como polipéptido (ELP), com ou sem a adição dos péptidos de penetração de células SynB1 ou Tat, através do intranasal (IN) e intravenosa (IV) vias de administração.
Protocol
Representative Results
Discussion
Enquanto ex vivo de imagem de órgão inteiro é geralmente simples, a adesão a alguns conceitos e técnicas básicas podem melhorar a precisão das medições de bio-distribuição. comprimentos de onda curtos da luz experiência um elevado grau de espalhamento e a absorvância na maioria dos tecidos, o que tem um impacto significativo a utilidade dos fluoróforos de curto comprimento de onda. Estes fluoróforos têm aplicação em estudos de tecidos profundos limitado, mas eles têm sido usados com efi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Partial salary support for GLB is provided by NIH grant R01HL121527. JWDM is supported by the Currier Fellowship in Neurology.
Materials
| Reagents | |||
| Maleimide derivitized fluorophors (e.g. tetramethylrhodamine-5-maleimide, AlexaFluor 633-C5-maleimide) | Thermo Fisher | T6027, A20342 | Thiol reactive fluorescent dyes for protein labeling |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | 1002243569 | PBS Buffer for rinsing |
| Optimal Cutting Temperature Compound | Tissue-Tek | 4585 | Used for freezing and mounting |
| Equipment | |||
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | For ex vivo whole organ imaging | |
| Cryomicrotome | Thermo | For cryosectioning | |
| Fluorescence slide scanner | Perkin Elmer | For slide scanning |
References
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