사용<em> 전의 VIVO</em> 전체 기관 이미징 및 정량 조직 조직학는 형광 표지 된 분자의 생물 분포를 확인하는 방법
Summary
생체 전체 기관 이미징 내에서 조직 또는 치료 군간 형광 표지 된 화합물의 상대적 농도를 결정하기위한 빠른 방법이다. 더욱 노동 집약적 인 반면 반대로 정량적 형광 조직학, 표지 분자의 절대 조직 레벨의 정량을 허용한다.
Abstract
형광 표식은 시험 관내 및 생체 내 실험은 다양한 조건하에 표지 된 분자의 운명을 조사하기위한 잘 확립 된 방법이다. 형광 프로브는 소형 분자 형광 라벨의 첨가 반응 속도 또는 화합물의 생체 분포에 영향을 미칠 가능성이 투여 큰 분자의 생체 분포를 결정하는데 특히 유용하다. 다양한 방법이 필요한 노력의 양이 현저하게 변화하고 생체 분포를 조사하기 위해 존재 얻어진 측정 완전히 정량적이지만, 생체 분포 분석을위한 신속하고 효율적인 시스템을 제공 할 수있는 결합 된 여러 방법들을 사용 여부.
생체 전체 기관 촬상 신속하고 조직 내 또는 조직 치료 집단의 여러 유형의 형광 분자 사이의 상대 농도를 비교하는 데 사용될 수있는 방법이다. 이미징 작은지면을 사용하여손상 조직 내에 살아있는 동물 또는 전체 기관 촬상 형광 설계된 형태 전체적인 생체 분포의 정확한 정보를 제공하면서 시간과 노동력을 절감 추가 처리없이 결정될 수있다. 이 공정은 화합물의 조직 특이성을 결정하기 위해 시도하는 실험에서 또는 다수의 상이한 화합물의 비교에 적합하다. 반면에, 양 조직 조직학은 표지 된 화합물의 정량적 인 측정 값을 생성하기 위하여 조직의 광범위한 추가 처리를 필요로한다. 정확하게 생체 분포를 평가하기 위해, 관심있는 모든 조직 슬라이스를 스캔하고, 조직 또는 그룹 간 비교를 위하여 표준 곡선에 대하여 분석한다. 정량적 조직 조직학은 조직 내에서 절대 화합물의 농도를 결정하기위한 금 표준이다.
여기서, 우리는 두 가지 방법은 다른 투여 방법 (A)의 능력을 평가하기 위해 함께 효과적으로 사용될 수있는 방법을 설명차 복합 수정 대상 및 중추 신경계 (1)에 형광 표지 된 분자를 제공합니다.
Introduction
형광 표지는 화합물의 생체 분포를 결정하는 많은 실험실 장비에 공통 인 범위를 사용하는, 쉽게 활용하고 효과적인 방법이다. 형광은 비교적 저렴하고 광범위하게 이용할 수 있으며, 다수의 표지 분자는 간섭없이 동시에 이용 될 수있는 파장의 다양한 온. 대부분의 형광 물질은 표적 화합물에서 다른 반응성 그룹에 대한 화학 결합의 범위를 가지며, 접합 과정은 반응성 부위 점유율 타입 일반적 쉽다. 또한, 형광 표지 된 화합물의 측정에 필요한 장비는 많은 실험실에서 일반적이다. 형광 현미경 이미 저들 및 슬라이드 스캐너 모두 형광 라벨의 사용이 매우 접근 할 수 있도록 다양한 상황에서 사용될 수있다. 형광 라벨은 종종 빕 생체와 전 두 화합물의 생체 분포 및 반응 속도를 결정하는 데 사용예 IVIS 스펙트럼 이미 저와 같은 양적 조직의 조직 학적 2,3에 의해 라이브 영상 장치와 오.
실시간 이미징 장치를 사용하여 생체 전체 기관 이미징의 사용으로 인해 사용 신속 tissues4의 추가 처리를 필요로하지 않고 표지 된 화합물의 상대적 농도의 정확한 비교를 생성하는 능력의 용이성으로 시간이 지남에 따라 증가했다. 생체 전체 기관 촬상 쉽게 분석 및 비교를 동시에 할 수 있지만, 그 조직 내에서 절대 화합물 농도의 정량적 측정 값을 생성하지 않는다. 이것은 그대로 장기 내의 광 산란 효과 때문이다. (조금 적게, 흡광도와) 광 산란 조직의 크기와 밀도에 따라 다양하기 때문에, 전체 기관 이미징 크거나 조밀 한 기관에서 조직의 수준을 과소 평가 할 수 있습니다. 한 두께를 모방해야하므로 절대적 농도 측정에 적합한 표준을 수립하기 어렵다각 개별 기관의 밀도. 한편, 전체 기관 이미징 에이전트의 상대적인 조직 수준을 얻는 신속한 방법이며, (예를 들면 약물 표적 연구에서와 같이) 여러 관련 분자의 상대적 생체 분포를 비교하기에 적합하다. 또 다른 전략은 정량적 형광 조직학 정량적 오토 라디오 그래피의 방법으로부터 유도 된 기술을 활용하는 시험 제제의 절대 5,6- 조직 수준을 얻을 수있다. 오히려 상상 장치에 전체 동물 또는 기관을 배치보다 양적 조직의 조직 학적 각 조직 스캔 슬라이드에 장착, 분리, 개별적으로 분석해야합니다. 시험 제제의 표준 제조하고 기관 샘플과 동일한 두께로 슬라이스된다. 동일한 두께로 모든 장기 및 표준을 절단함으로써, 빛의 산란 또는 흡수로 인한 변동을 제거하고, 조직 형광 강도 절대 승낙을 결정하는 표준 곡선에 적합 할 수있다정액. 제대로하는이 방법은, 정량적 인 반면, 노동 집약적 쉽게 걸린이다. 전체 기관 촬상 비교하면 양적 조직학 및 노동의 상당히 높은 비용보다 복잡한 특성상 각 공정은 형광 표지 된 화합물의 생체 분포를 검사하는 경우에 사용하는 대부분의 실용적이다 검사 가치가된다. 이 프로토콜을 통해, 이러한 방법으로 또는 SynB1 또는 타트 세포 투과 펩티드를 첨가하지 않고 효율적 로다 민 – 표지 된 엘라스틴 같은 폴리펩티드 (ELP)의 생체 분포를 비교하기 위해 함께 사용될 수있는 방법의 상세한 설명을 제공한다 비내 (IN) 및 정맥 내 (IV) 투여 경로.
Protocol
Representative Results
Discussion
생체 전체 기관 촬상 일반적으로 간단하지만, 기본 개념 및 기술에 부착 바이오 분포 측정의 정확도를 향상시킬 수있다. 광 경험 단파장 대부분의 조직에서의 산란과 흡수가 높은 유의 한 영향 단파장 형광체의 유용성. 이러한 형광체는 깊은 조직 연구에 응용이 제한되어 있지만, 표면 조직 또는 눈으로 보는 실험에서 효과적으로 사용되어왔다. 반대로, 빛의 긴 파장은 더 큰 침투 두꺼운 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Partial salary support for GLB is provided by NIH grant R01HL121527. JWDM is supported by the Currier Fellowship in Neurology.
Materials
| Reagents | |||
| Maleimide derivitized fluorophors (e.g. tetramethylrhodamine-5-maleimide, AlexaFluor 633-C5-maleimide) | Thermo Fisher | T6027, A20342 | Thiol reactive fluorescent dyes for protein labeling |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | 1002243569 | PBS Buffer for rinsing |
| Optimal Cutting Temperature Compound | Tissue-Tek | 4585 | Used for freezing and mounting |
| Equipment | |||
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | For ex vivo whole organ imaging | |
| Cryomicrotome | Thermo | For cryosectioning | |
| Fluorescence slide scanner | Perkin Elmer | For slide scanning |
References
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