Kullanımı<em> Ex Vivo</em> Tüm organ Görüntüleme ve Kantitatif Doku Histoloji floresan etiketli Moleküllerin Biyo-dağılımını belirlemek için
Summary
Ex vivo bütün organ görüntüleme içinde ve doku veya tedavi grupları arasında floresan etiketli bileşiklerin görece konsantrasyonlarının belirlenmesi için hızlı bir yöntem. Daha fazla emek yoğun ise aksine, kantitatif fluoresans histolojisi, işaretli moleküllerin mutlak doku seviyelerinin ölçümü için izin verir.
Abstract
Floresan etiketleme in vitro ve hem de in vivo deneysel koşullar altında çeşitli işaretli moleküllerin kaderini incelemek için iyi bilinen bir işlemdir. Floresan probları bir küçük moleküllü floresan işarete ilave kinetiği ya da bu bileşiğin biyo-dağılımı etkileyecek olası değildir tatbik büyük moleküllerin biyolojik dağılımını belirlenmesinde özellikle yararlıdır. çeşitli yöntemler gerekli çaba miktarda önemli ölçüde değişebilir ve biyo-dağılımını incelemek ana kadar elde edilen ölçümler, tam miktar, ancak biyo-dağılımı analiz etmek için hızlı ve etkili bir sistem sağlayabilir bağlantılı olarak, çeşitli yöntemler kullanılarak ister.
Ex vivo bütün organ görüntüleme hızlı doku içinde ve doku veya tedavi gruplarının çok tip arasındaki flüoresan moleküllerinin görece konsantrasyonlarının karşılaştırma kullanılabilecek bir yöntemdir. Bir görüntüleme plat kullanılmasıdokulara içinde canlı hayvan veya bütün organ görüntüleme, floresan için tasarlanmış form genel biyo-dağılımının doğru bir resim sağlarken zamandan ve işçilikten tasarruf, başka bir işleme tabi belirlenebilir. Bu işlem, bir bileşiğin doku özgüllüğünü belirlemeye çalışan deneylerde veya birden fazla farklı bileşiklerin karşılaştırma için idealdir. Öte yandan kantitatif doku histolojisi etiketli bileşiklerin nicel ölçü oluşturmak üzere dokuların detaylı ilave işlem gerektirmektedir. doğru biyo-dağılımını değerlendirmek için, ilgilenilen tüm dokular, dilimlenmiş taranır ve dokular veya gruplar arasında karşılaştırmalar yapmak için standart eğrileri göreli analiz edilmelidir. Kantitatif doku histoloji dokuları içinde mutlak bileşik konsantrasyonlarını belirlemek için altın standarttır.
Burada, her iki yöntem, farklı uygulama yöntemleri, bir yeteneğinin tayin edilmesi için bir arada etkin bir kullanım şeklini açıklarnd bileşik değişiklikler hedef ve merkezi sinir sisteminde 1'e floresan etiketli molekülleri teslim etmek.
Introduction
Floresan etiketleme bileşiklerin biyo-dağılımını belirlemek birçok laboratuvar için ortak olan bir ekipman kullanılarak çeşitli için kolaylıkla kullanılabilir ve etkili bir yöntemdir. Fluorophores nispeten ucuz, yaygın olarak kullanılabilir ve birden etiketli moleküller müdahalesi olmadan aynı anda kullanılabilir şekilde dalga boylarında, çeşitli gelir. Çoğu fluorophores hedef bileşiklere farklı reaktif gruplara konjugasyon için kimyaları bir dizi var ve konjugasyon süreci reaktif sitelerin çoğu türleri için genellikle basittir. Buna ek olarak, floresan etiketli bileşiklerin ölçümü için gerekli olan ekipmanın birçok laboratuvar yaygındır. Floresan mikroskoplar, kameralar, ve slayt tarayıcıları tüm florasan etiketleme kullanımı son derece erişilebilir hale farklı durumlarda kullanılabilir. Floresan etiketler sıklıkla viv in vivo ve ex hem bileşiklerin biyo-dağılımı ve kinetiklerini belirlemek için kullanılırBöyle IVIS Spektrum Imager olarak ve kantitatif doku histolojisi 2,3 canlı görüntüleme cihazları ile o.
Canlı görüntüleme cihazları kullanılarak ex vivo olarak bütün organ görüntüleme kullanımı nedeniyle kullanımı ve hızlı bir şekilde tissues4 daha işlem gerektirmeden etiketli bileşiklerin nispi konsantrasyonlarının doğru bir karşılaştırma oluşturma yeteneği kolaylıklan zamanla artmıştır. Ex vivo olarak bütün organ görüntüleme kolay analiz ve karşılaştırma için izin verebilir ancak bununla birlikte, bir doku içinde, mutlak bileşik konsantrasyonları bir nicel ölçümünü oluşturmaz. Bu dokunulmamış organlar içindeki ışık dağıtma etkilerine bağlıdır. (Daha az bir ölçüde, absorbans ve) ışık saçılımı doku büyüklüğüne ve yoğunluğuna göre değiştiğinden, bütün organın görüntülenmesi büyük veya yoğun organlarda doku düzeylerini hafife. bir kalınlığa taklit gerekir çünkü mutlak konsantrasyon ölçümleri için uygun standartlar formüle da zordurve her bir organ yoğunluğu. Diğer taraftan, bütün organın görüntülenmesi bir maddenin göreli doku seviyelerini elde etmek için bir hızlı bir yöntemdir ve bu (örneğin ilaç hedefleme çalışmalarda olduğu gibi) çok sayıda ilgili moleküllerin nispi biyo-dağılımı karşılaştırma için idealdir. Alternatif bir diğer strateji, kantitatif fluoresans histolojisi, kantitatif otoradyografi için açıklanan yöntemle elde edilen bir teknik kullanmak için bir deney maddesinin 5,6 mutlak doku düzeylerini elde etmektir. Aksine bir hayal cihaz içine bütün bir hayvan ya da bir organ yerleştirerek daha, nicel doku histolojisi her doku taranan slaytlar, üzerine monte edilmiş, dilimlenmiş ve bireysel analiz gerektirir. Test maddesinin Standartları hazırlanmış ve organ örnekleri gibi aynı kalınlıkta dilimlenir. Aynı kalınlığa tüm organ ve standartlar keserek ışını tarama ya da emiş nedeniyle değişkenlik ortadan kalkar, ve doku floresan yoğunluğu, mutlak konsantrasyonlarda belirlemek için standart eğriye uydurulmuş olabilirrasyon. doğru yapılan bu yöntem, kantitatif olsa da, aynı zamanda, emek-yoğun ve kolay bir şekilde hatalı olduğunu. Bütün organ görüntüleme ile karşılaştırıldığında nicel histoloji ve emek önemli ölçüde daha yüksek maliyetle daha karmaşık doğası göz önüne alındığında, her süreç floresan etiketli bileşiklerin biyo-dağılımını incelerken kullanmak en pratik olduğu incelemek için değerli hale gelir. Bu protokol ile, bu yöntemler ya da SynB1 veya TAT hücre nüfuz peptitlerinin ilavesi olmadan etkili bir şekilde rodamin etiketli elastin gibi polipeptit (ELP) biyo-dağılımı karşılaştırma birlikte kullanılabilir dair ayrıntılı bir açıklama sağlar intranazal (İN) ve damar içi (IV) uygulama yolları.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ex vivo bütün organ görüntüleme genellikle basit olmakla birlikte, bazı temel kavram ve tekniklerine bağlılık biyo-dağıtım ölçümlerin doğruluğunu artırabilir. Işık deneyimi kısa dalga boyları çoğu dokularda saçılma ve absorbans yüksek derecede anlamlı olan etkileri kısa dalga boylu fluorophores yarar. Bu fluorophores derin doku çalışmalarında uygulama sınırlı, ama onlar yüzey dokuları ya da göz içine bakarak deneylerde etkin olarak kullanılmaktadır. Tersine, ışığın…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Partial salary support for GLB is provided by NIH grant R01HL121527. JWDM is supported by the Currier Fellowship in Neurology.
Materials
| Reagents | |||
| Maleimide derivitized fluorophors (e.g. tetramethylrhodamine-5-maleimide, AlexaFluor 633-C5-maleimide) | Thermo Fisher | T6027, A20342 | Thiol reactive fluorescent dyes for protein labeling |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | 1002243569 | PBS Buffer for rinsing |
| Optimal Cutting Temperature Compound | Tissue-Tek | 4585 | Used for freezing and mounting |
| Equipment | |||
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | For ex vivo whole organ imaging | |
| Cryomicrotome | Thermo | For cryosectioning | |
| Fluorescence slide scanner | Perkin Elmer | For slide scanning |
References
- George, E. M., Liu, H., Robinson, G. G., Bidwell, G. L. A Polypeptide Drug Carrier for Maternal Delivery and Prevention of Fetal Exposure. J. Drug Target. 22 (9), 1133-1145 (2014).
- George, E. M., Liu, H., et al. Growth factor purification and delivery systems (PADS) for therapeutic angiogenesis. Vasc. Cell. 7 (1), 1-11 (2015).
- Bidwell, G. L., Perkins, E., Hughes, J., Khan, M., James, J. R., Raucher &, D. Thermally Targeted Delivery of a c-Myc Inhibitory Polypeptide Inhibits Tumor Progression and Extends Survival in a Rat Glioma Model. PLoS One. 8 (1), (2013).
- Liu, H., Zhang, W., et al. The improved blood–brain barrier permeability of endomorphin-1 using the cell-penetrating peptide synB3 with three different linkages. Int. J. Pharm. 476 (1-2), 1-8 (2014).
- Flessner, M. F., Fenstermacher, J. D., Blasberg, R. G., Dedrick, R. L. Peritoneal absorption of macromolecules studied by quantitative autoradiography. Am. J. Physiol. 248, 26-32 (1985).
- Flessner, M. F., Choi, J., He, Z., Credit, K. Physiological characterization of human ovarian cancer cells in a rat model of intraperitoneal antineoplastic therapy. J Appl Physiol. 97, 1518-1526 (2004).
- Kennedy, H. S., Jones, C., Caplazi, P., Iii, C. J., Caplazi, P. Comparison of standard laminectomy with an optimized ejection method for the removal of spinal cords from rats and mice. J. Histotechnol. 36 (3), 86-91 (2013).
- Currle, D. S., Monuki, E. S. E. Flash Freezing and Cryosectioning E12.5 Mouse Brain. J. Vis. Exp. JoVE. (4), e198 (2007).
- Walker, L., Perkins, E., Kratz, F., Raucher &, D. Cell penetrating peptides fused to a thermally targeted biopolymer drug carrier improve the delivery and antitumor efficacy of an acid-sensitive doxorubicin derivative. Int. J. Pharm. 436 (1-2), 825-832 (2012).
- Frangioni, J. V. In vivo near-infrared fluorescence imaging. Curr. Opin. Chem. Biol. 7 (5), 626-634 (2003).
- Vugmeyster, Y. Pharmacokinetics and toxicology of therapeutic proteins: Advances and challenges. World J. Biol. Chem. 3 (4), 73 (2012).
- Stumpf, W. E. Whole-body and microscopic autoradiography to determine tissue distribution of biopharmaceuticals – Target discoveries with receptor micro-autoradiography engendered new concepts and therapies for vitamin D. Adv. Drug Deliv. Rev. 65 (8), 1086-1097 (2013).
