Brugen af<em> Ex vivo</em> Hele-orgel Imaging og kvantitativ Tissue Histologi at Bestem Bio-distribution af fluorescens-mærkede molekyler
Summary
Ex vivo hel-organ imaging er en hurtig metode til bestemmelse af de relative koncentrationer af fluorescens mærkede forbindelser inden for og mellem væv eller behandlingsgrupper. Omvendt kvantitativ fluorescens histologi, mens mere arbejdskrævende, giver mulighed for kvantificering af de absolutte væv niveauer af mærkede molekyler.
Abstract
Fluorescerende mærkninger er en veletableret fremgangsmåde til at undersøge skæbne af mærkede molekyler under forskellige eksperimentelle betingelser både in vitro og in vivo. Fluorescerende prober er særligt anvendelige til bestemmelse af biodistribution af administrerede store molekyler, hvor tilsætning af en lille-molekyle fluorescerende mærke påvirker sandsynligvis kinetik eller bio-fordeling af forbindelsen. En række fremgangsmåder er til for at undersøge biodistributionen der varierer betydeligt i mængden af nødvendige indsats og om de heraf målinger er fuldt kvantitativ, men ved hjælp af flere metoder i forbindelse kan tilvejebringe en hurtig og effektiv system til analyse bio-fordelinger.
Ex vivo hel-organ billeddannelse er en metode, der kan bruges til hurtigt at sammenligne de relative koncentrationer af fluorescerende molekyler i væv og mellem flere typer af væv eller behandlingsgrupper. Brug af en billeddannende platform med henblik levende dyr eller hel-organ billeddannelse, fluorescens inden intakte væv kan bestemmes uden yderligere behandling, hvilket sparer tid og arbejdskraft, samtidig med at et præcist billede af den samlede bio-fordeling. Denne proces er ideel til forsøg forsøger at bestemme vævsspecificitet af en forbindelse eller til sammenligning af flere forskellige forbindelser. Kvantitativ væv histologi derimod kræver omfattende yderligere behandling af væv med henblik på at skabe et kvantitativt mål for de mærkede forbindelser. For præcist at vurdere bio-fordeling, skal alle væv af interesse skiver, scannes, og analyseret i forhold til standard kurver for at foretage sammenligninger mellem væv eller grupper. Kvantitativ væv histologi er den gyldne standard for bestemmelse af absolutte sammensatte koncentrationer inden væv.
Her beskriver vi, hvordan begge metoder kan anvendes effektivt sammen for at vurdere evnen af forskellige administrationsmetoder ennd sammensatte modifikationer til at målrette og levere fluorescensmærkede molekyler til centralnervesystemet 1.
Introduction
Fluorescerende mærkning er et nemt udnyttes og effektiv metode til bestemmelse af biodistribution af forbindelser, ved anvendelse af en række af udstyr, der er fælles for mange laboratorier. Fluoroforer er bredt tilgængelige, relativt billige, og kommer i mange forskellige bølgelængder, således at multiple mærkede molekyler kan anvendes samtidigt uden indblanding. De fleste fluoroforer har en række kemier til konjugering til forskellige reaktive grupper på målforbindelser, og processen med konjugation er generelt ligetil for de fleste typer af reaktive steder. Derudover det nødvendige udstyr til målingerne af fluorescensmærkede forbindelser er almindelige i mange laboratorier. Fluorescerende mikroskoper, kameraer og dias scannere kan alle anvendes under forskellige omstændigheder, som gør brugen af fluorescerende mærkning meget tilgængeligt. Fluorescerende mærker anvendes hyppigt til at bestemme biodistributionen og kinetik af forbindelser både in vivo og ex vivo med levende imaging enheder, såsom IVIS Spectrum Imager, og ved kvantitativ væv histologi 2,3.
Brugen af ex vivo hel-orgel imaging brug af live-billeddannende indretninger er steget over tid på grund af deres brugervenlighed og evne til hurtigt at oprette en nøjagtig sammenligning af de relative koncentrationer af mærkede forbindelser uden at kræve yderligere behandling af tissues4. Men mens ex vivo hel-organ- billeddannelse kan åbne mulighed for nem analyse og sammenligning, det genererer ikke en kvantitativ måling af absolutte koncentrationer forbindelse inden et væv. Dette skyldes lysspredning virkninger inden intakte organer. Eftersom lysspredning (og, i mindre omfang, absorbans) varierer ved væv størrelse og tæthed, kan hel-organ- billeddannelse undervurdere vævsniveauer i store eller tætte organer. Formulere passende standarder for absolutte koncentrationsmålinger er også svært, fordi man skal efterligne tykkelsenog densiteten af hvert enkelt organ. På den anden side, hel-organ billeddannelse er en hurtig metode til at opnå de relative vævsniveauer af en agent, og det er ideelt til sammenligning af den relative biodistribution af multiple relaterede molekyler (såsom i lægemiddelmålretning undersøgelser). En alternativ strategi er at anvende kvantitativ fluorescens histologi, en teknik afledt af metode til kvantitativ autoradiografi til opnåelse absolutte vævsniveauer af et testmiddel 5,6. Snarere end at placere en hel dyr eller organ i en imagining enhed, kvantitativ væv histologi kræver, at hver væv skæres i skiver, monteret på dias, scannede, og analyseret individuelt. Standarder for testmidlet fremstilles og skåret på samme tykkelse som de organprøver. Ved at skære alle organer og standarder til samme tykkelse, er variabilitet skyldes lysspredning eller absorbans elimineret, og væv fluorescensintensiteten kan være egnet til at standardkurven for at bestemme absolut concentrationere. Selv om denne fremgangsmåde, når det gøres ordentligt, er kvantitativ, er det også arbejdskrævende og nemt mishandlet. I betragtning af den mere komplekse karakter af kvantitativ histologi og den væsentligt højere omkostninger på arbejdskraft i forhold til hel-orgel billedbehandling, bliver det umagen værd at undersøge, hvor hver proces er mest praktisk at bruge, når man undersøger bio-distribution af fluorescens mærkede forbindelser. Denne protokol giver en detaljeret beskrivelse af, hvordan disse fremgangsmåder kan anvendes sammen til effektivt sammenligne biodistribution af rhodamin-mærket Elastin-lignende polypeptid (ELP), med eller uden tilsætning af SynB1 eller Tat-celle-penetrerende peptider, via intranasal (IN) og intravenøs (IV) administrationsveje.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mens ex vivo hel-orgel imaging er generelt ligetil, kan overholdelsen af nogle grundlæggende begreber og teknikker forbedre nøjagtigheden af bio-distributions- målinger. Korte bølgelængder af lys erfaring en høj grad af spredning og absorbansen i de fleste væv, som i væsentlig grad påvirker nytte af de korte bølgelængde fluoroforer. Disse fluorophorer har begrænset anvendelse i dyb-væv studier, men de har været anvendt effektivt i forsøg ser på overfladen væv eller ind i øjet. Omvendt lange b?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Partial salary support for GLB is provided by NIH grant R01HL121527. JWDM is supported by the Currier Fellowship in Neurology.
Materials
| Reagents | |||
| Maleimide derivitized fluorophors (e.g. tetramethylrhodamine-5-maleimide, AlexaFluor 633-C5-maleimide) | Thermo Fisher | T6027, A20342 | Thiol reactive fluorescent dyes for protein labeling |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma | 1002243569 | PBS Buffer for rinsing |
| Optimal Cutting Temperature Compound | Tissue-Tek | 4585 | Used for freezing and mounting |
| Equipment | |||
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | For ex vivo whole organ imaging | |
| Cryomicrotome | Thermo | For cryosectioning | |
| Fluorescence slide scanner | Perkin Elmer | For slide scanning |
References
- George, E. M., Liu, H., Robinson, G. G., Bidwell, G. L. A Polypeptide Drug Carrier for Maternal Delivery and Prevention of Fetal Exposure. J. Drug Target. 22 (9), 1133-1145 (2014).
- George, E. M., Liu, H., et al. Growth factor purification and delivery systems (PADS) for therapeutic angiogenesis. Vasc. Cell. 7 (1), 1-11 (2015).
- Bidwell, G. L., Perkins, E., Hughes, J., Khan, M., James, J. R., Raucher &, D. Thermally Targeted Delivery of a c-Myc Inhibitory Polypeptide Inhibits Tumor Progression and Extends Survival in a Rat Glioma Model. PLoS One. 8 (1), (2013).
- Liu, H., Zhang, W., et al. The improved blood–brain barrier permeability of endomorphin-1 using the cell-penetrating peptide synB3 with three different linkages. Int. J. Pharm. 476 (1-2), 1-8 (2014).
- Flessner, M. F., Fenstermacher, J. D., Blasberg, R. G., Dedrick, R. L. Peritoneal absorption of macromolecules studied by quantitative autoradiography. Am. J. Physiol. 248, 26-32 (1985).
- Flessner, M. F., Choi, J., He, Z., Credit, K. Physiological characterization of human ovarian cancer cells in a rat model of intraperitoneal antineoplastic therapy. J Appl Physiol. 97, 1518-1526 (2004).
- Kennedy, H. S., Jones, C., Caplazi, P., Iii, C. J., Caplazi, P. Comparison of standard laminectomy with an optimized ejection method for the removal of spinal cords from rats and mice. J. Histotechnol. 36 (3), 86-91 (2013).
- Currle, D. S., Monuki, E. S. E. Flash Freezing and Cryosectioning E12.5 Mouse Brain. J. Vis. Exp. JoVE. (4), e198 (2007).
- Walker, L., Perkins, E., Kratz, F., Raucher &, D. Cell penetrating peptides fused to a thermally targeted biopolymer drug carrier improve the delivery and antitumor efficacy of an acid-sensitive doxorubicin derivative. Int. J. Pharm. 436 (1-2), 825-832 (2012).
- Frangioni, J. V. In vivo near-infrared fluorescence imaging. Curr. Opin. Chem. Biol. 7 (5), 626-634 (2003).
- Vugmeyster, Y. Pharmacokinetics and toxicology of therapeutic proteins: Advances and challenges. World J. Biol. Chem. 3 (4), 73 (2012).
- Stumpf, W. E. Whole-body and microscopic autoradiography to determine tissue distribution of biopharmaceuticals – Target discoveries with receptor micro-autoradiography engendered new concepts and therapies for vitamin D. Adv. Drug Deliv. Rev. 65 (8), 1086-1097 (2013).
