Testen des Vascular Invasive Fähigkeit von Krebszellen in Zebrabärbling (<em> Danio rerio</em>)

Summary

Dieses Verfahren nutzt Zebrabärblingembryonen effizient die Gefäß invasive Fähigkeit von Krebszellen zu testen. Fluoreszierende Krebszellen werden in den precardiac Sinus oder Dottersack von sich entwickelnden Embryonen injiziert. Krebszelle Gefäßinvasion und Extravasation wird über Fluoreszenzmikroskopie des Heckbereich 24 bis 96 Stunden später bewertet.

Abstract

Cancer cell vascular invasion and extravasation is a hallmark of metastatic progression. Traditional in vitro models of cancer cell invasion of endothelia typically lack the fluid dynamics that invading cells are otherwise exposed to in vivo. However, in vivo systems such as mouse models, though more physiologically relevant, require longer experimental timescales and present unique challenges associated with monitoring and data analysis. Here we describe a zebrafish assay that seeks to bridge this technical gap by allowing for the rapid assessment of cancer cell vascular invasion and extravasation. The approach involves injecting fluorescent cancer cells into the precardiac sinus of transparent 2-day old zebrafish embryos whose vasculature is marked by a contrasting fluorescent reporter. Following injection, the cancer cells must survive in circulation and subsequently extravasate from vessels into tissues in the caudal region of the embryo. Extravasated cancer cells are efficiently identified and scored in live embryos via fluorescence imaging at a fixed timepoint. This technique can be modified to study intravasation and/or competition amongst a heterogeneous mixture of cancer cells by changing the injection site to the yolk sac. Together, these methods can evaluate a hallmark behavior of cancer cells and help uncover mechanisms indicative of malignant progression to the metastatic phenotype.

Introduction

Metastatische Erkrankung ist eine Hauptursache der Krebssterblichkeit und viele Mechanismen, die Krebszelle ermöglichen Verbreitung bleiben bis ¹ entdeckt werden. Um für eine Krebszelle, um erfolgreich zu metastasieren, muss er zunächst durch das Stroma eindringen, die eine primäre Tumor umgibt, geben Sie (intravasate) in das Kreislaufsystem, überleben auf der Durchreise, Ausfahrt (extravasate) aus dem Kreislauf und schließlich eine tragfähige Kolonie gründen am entfernten Organstelle ^2. Intravasation und Extravasation sind somit entscheidende Schritte in der metastatischen Kaskade, doch jeder Krebszelle ist nicht von Natur geschickt darin zu stören und die Migration durch endotheliale Kreuzungen ^3. In der Tat gibt es eine Reihe von einzigartigen Selektionsdruck , die Krebszellen vaskuläre Invasion und der Prozess umgeben kann weiterhin durch eine Vielzahl von endogenen und exogenen Faktoren ⁴ beeinflusst werden. Aus diesen Gründen Techniken, die das aggressive Verhalten von fortgeschrittenen Stadium Krebs Sonde konzentrieren sich häufig auf vascular invasive Fähigkeit als Mittel Metastasierung zu prognostizieren.

Verschiedene Modellsysteme existieren , um die Untersuchung von Krebszellen Gefäßinvasion in vitro zu erleichtern. Die am häufigsten verwendete in vitro Assays beinhalten entweder Transwell – Systemen Krebszellmigration durch eine endotheliale Schranke ⁵ oder Elektro Zell-Substrat – Impedance Sensing (ECIS) Technologie zur Überwachung des Echtzeit – Unterbrechung einer intakten endothelialen Monoschicht durch Krebszellen ⁶ zu bewerten. Diese Tests fehlt typischerweise die Fluiddynamik und Stroma-Faktoren, die sonst Krebszellbindung an eine Endothelwand auswirken würde. Dieses Problem wird etwas von perfundierbaren Gefäßnetze umgangen , die aus dem 3D – Kultur von Endothel entstehen mit Stromazellen zu unterstützen und diese 3D – Mikrofluidik – Systeme nun die Spitze der aktuellen In – vitro – Optionen ^7,8 darstellen. Dennoch auslassen diese Ansätze die robuste Mikro eines funktionellen Kreislaufsystemund daher nur teilweise Ersatz für die in vivo – Modellen.

Die am häufigsten in – vivo – Modell von Gefäßinvasion verwendet wird , ist die Maus, bei der experimentellen Metastasierung Assays häufig durchgeführt werden , weil sie auf relativ kurze Zeiträume und sind in der Regel bezeichnend für Metastasierungsfähigkeit ⁹ auftreten. Diese Tests umfassen die direkte Injektion von Krebszellen in den Verkehr und damit die Endstadien der Metastasierung zu modellieren, nämlich Extravasation und Krebszellbesiedelung von Organen. Die experimentellen Metastasierung Assays unterscheiden sich an der Stelle der Krebszellinjektion basiert und die Organe schließlich analysiert. Im ersten Assay – Typ, Krebszellen in die Schwanzvene von Mäusen und Krebszellaussaat in der Lunge injiziert werden , wird ^10,11 überwacht. Der zweite Test beinhaltet die Durchführung intrakardiale Injektionen metastatic seeding in Richtung auf die Knochenmikro ^12-14, sondern auch das Gehirn ¹⁵ zu lenken. In dem dritten Test, Krebs cells werden in die Milz injiziert , um Besiedlung der Leber ¹⁶ zu ermöglichen , während die vierte Lieferroute in die Arteria carotis Krebszellen zum Gehirn ^17,18 trägt. Unabhängig von der Krebszelle Liefermethode, Organ Kolonisation ist die akzeptierte experimentellen Endpunkt und wird in der Regel über Lumineszenz, Histologie bestimmt, oder PCR-basierte Techniken. Trotz der physiologischen Vorteile von innerhalb eines murinen Wirt experimentellen Metastasierung Assays Durchführung dieser Experimente erfordern noch Wochen bis Monate abzuschließen und zu analysieren.

Der Zebrafisch (Danio rerio) -Modell hat sich kürzlich als neuer Systemkrebsprogression ^19,20, zu untersuchen und ermöglicht die Beurteilung von Krebszellen vaskuläre Invasion innerhalb eines Funktionskreislauf über einen viel kürzeren Zeitskala als bei Mäusen im Vergleich ^21-24. Das Verfahren nutzt einen transparenten Zebrabärbling-Stamm, der seine Endothel mit einem grünen Riffkoralle Fluo markiertrescent Protein Reporter durch die kdrl Promotor, der Zebrabärbling Rezeptor für den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor ²⁵ angetrieben. In dem Test werden die Krebszellen mit einem roten fluoreszierenden Marker markiert und in den precardiac Sinus von 2 Tage alten Embryonen injiziert. Irgendwo zwischen 48 bis 96 Stunden nach der Injektion von Krebszellen, die aus dem Gefäßsystem und in die Schwanzvene Region von Embryonen eingedrungen sind effizient auf einem Fluoreszenzmikroskop erzielt. Hier wir die Technik zu einer Gruppe von üblicherweise verwendeten humanen Brustkrebszelllinien gelten für stark Unterschiede in ihrer Gefäß invasive Fähigkeit demonstrieren. Darüber hinaus zeigen wir, dass für den Embryo yolk sac die Injektionsstelle zu ändern für die Untersuchung der heterogenen Zell-Interaktionen ermöglicht, als Krebszellpopulationen differentiell mit Fluoreszenzfarbstoffen und injiziert in Zebrabärbling-Embryonen fehlt Fluoreszenz Vaskulatur markiert werden. In diesem letzteren Test, Krebszellen, die das Eigelb eingedrungen sind und intravasated in die vasculature werden im kaudalen Bereich von 24 bis 48 Stunden nach der Injektion erzielt. Aufgrund der Effektivität und Komfort dieses Modells sind Zebrabärbling zunehmend die Gefäß invasive Fähigkeit von Krebszellen unter einer physiologischen Umgebung, um schnell zu testen eingesetzt.

Protocol

Ethik-Statement: Zebrabärbling-Embryonen erzeugt wurden nach einer genehmigten IACUC Protokoll. Diese Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Empfehlungen der Georgetown University Animal Care und Use Committee durchgeführt. 1. Organisieren Embryonen für Injection und erstellen Stammlösungen Generieren erforderlichen Zebrabärblingembryonen zur Krebszelle Gefäßinvasion beurteilen. Richten Sie paarweise oder Gruppe in Cross Paarung mit Tg (kdrl: grcfp) zn1…

Representative Results

Hier testeten wir die vaskuläre invasive Fähigkeit von häufig verwendeten Brustkrebszelllinien in einem Zebrafischembryo – Modell (Abbildung 1). Rigorose Kriterien wurden in Scoring-Extravasation für diese verschiedenen Zelllinien eingesetzt werden, wo positive Ereignisse nur dann, wenn die Krebszellen gezählt wurden deutlich extravasierten hatte, dieses Wesen hauptsächlich getan keine Falsch-Positiven zu begrenzen, die von Scoring Zelltrümmer entstehen könnten. …

Discussion

Diese Technik nutzt die Zebrabärbling Modell zur effizienten Steuerung des Gefäß invasive Fähigkeit von Krebszellen zu testen (siehe Abbildung 1). Hier verwendeten wir die Technik zu einer Gruppe von Brustkrebszelllinien , um eine Basislinie zu schaffen , auf die andere Forscher können dann ihre eigenen Studien bauen (siehe Tabelle 1; Figuren 2 – 3). Die Beobachtung, dass MDA-MB-231-Zellen leicht in die Schwanzregion Genaktivität fallen würde diese Zelllinie idea…

Materials

0.05% Trypsin-EDTA	Life Technologies	25300-054
100mm Dishes	Corning Incorporated	3160-100
5 3/4" Disposable Pastur Pipets, borosilicate Glass	Fisher Brand	13-678-20B
60 mm Dish	Corning Incorporated	3160-60
Agarose, Low Melting	Fisher	BP165-25
Agarose, Molecular Grade	Bioline	BIO-41026
Capillary Glass, Standard, 1.2MM x 0.68MM, 4"	A-M Systems, Inc	627000
David Kopf 700C Vertical Pipette Puller	Hofstra Group	3600
DMEM	Life Technologies	11995-065
Electrode Storage Jar, 1.0MM	World Precision Instruments, Inc	E210
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine, MS-222)	Fluka	A5040
Eyelash Brush	Ted Pella, Inc	113
Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated	Omega Scientific	FB-12
Fisherbrand Transfer Pipettes	ThermoFisher Scientific	13-711-7M
Gel Loading Pipet Tips	Fisher Brand	02-707-181
Glass Bottom Dishes (12.0 mm)	ThermoFisher Scientific	150680
Glass Depression Slide	VWR	470005-634
Instant Ocean Salt, Sea Salt	Pentair	IS50
Latex Rubber Bulbs, 2mL, Pack of 72	Heathrow Scientific	HS20622B
SP8 Confocal Microscope	Leica
Micromanipulator	Narishige
Eclipse E600	Nikon
PBS	Life Technologies	10010-023
Penicillin-G Potassium	Fisher Biotech	BP914-100
Petri Plates, 100mm x 15mm	Fisher Brand	FB0875713
Picospritzer II	General Valve Corporation
RPMI 1640 Medium	Life Technologies	11875-093
Streptomycin Sulfate	Fisher Biotech	BP910-50
Vybrant DiI	ThermoFisher Scientific	V22885
Vybrant DiO	ThermoFisher Scientific	V22886
Zebrafish	Georgetown Zebrafish Shared Resources
Cell lines were maintained in DMEM + 10% FBS, with the expection of BT-474 and HCC18-6 cells, which were mantained in RPMI + 10% FBS.