Prueba de la capacidad vascular invasiva de células cancerosas en el pez cebra (<em> Danio rerio</em>)

Summary

Este método utiliza embriones de pez cebra para probar de manera eficiente la capacidad invasiva de células de cáncer vascular. células de cáncer fluorescentes se inyectan en el seno precardiaco o saco vitelino de embriones en desarrollo. células de cáncer de invasión vascular y la extravasación se evalúa a través de microscopía de fluorescencia de la región de la cola 24 a 96 horas más tarde.

Abstract

Cancer cell vascular invasion and extravasation is a hallmark of metastatic progression. Traditional in vitro models of cancer cell invasion of endothelia typically lack the fluid dynamics that invading cells are otherwise exposed to in vivo. However, in vivo systems such as mouse models, though more physiologically relevant, require longer experimental timescales and present unique challenges associated with monitoring and data analysis. Here we describe a zebrafish assay that seeks to bridge this technical gap by allowing for the rapid assessment of cancer cell vascular invasion and extravasation. The approach involves injecting fluorescent cancer cells into the precardiac sinus of transparent 2-day old zebrafish embryos whose vasculature is marked by a contrasting fluorescent reporter. Following injection, the cancer cells must survive in circulation and subsequently extravasate from vessels into tissues in the caudal region of the embryo. Extravasated cancer cells are efficiently identified and scored in live embryos via fluorescence imaging at a fixed timepoint. This technique can be modified to study intravasation and/or competition amongst a heterogeneous mixture of cancer cells by changing the injection site to the yolk sac. Together, these methods can evaluate a hallmark behavior of cancer cells and help uncover mechanisms indicative of malignant progression to the metastatic phenotype.

Introduction

La enfermedad metastásica es la causa principal de mortalidad por cáncer y muchos mecanismos que permiten la difusión de células de cáncer aún no se han descubierto ^1. A fin de que una célula de cáncer de metástasis con éxito, debe invadir primero a través del estroma que rodea a un tumor primario, introduzca (intravasate) en el sistema circulatorio, sobrevivir en tránsito, salida (extravasate) de la circulación, y, por último establecer una colonia viable en el sitio de órgano distante ^2. Intravasación y extravasación son, pues, los pasos cruciales en la cascada metastásica, sin embargo, cada célula de cáncer no es inherentemente adeptos a interrumpir y migrar a través de uniones endoteliales ^3. De hecho, hay una serie de presiones de selección únicos que rodean la invasión vascular de células de cáncer y el proceso puede ser influenciada además por una variedad de factores endógenos y exógenos ^4. Por estas razones, las técnicas que prueban la conducta agresiva de cáncer en etapa avanzada a menudo se centran en vascular capacidad invasora como un medio para predecir la propagación metastásica.

Existen diversos sistemas de modelos para facilitar el estudio de la invasión vascular de células de cáncer in vitro. El más utilizado en ensayos in vitro incluyen ya sea sistemas Transwell para evaluar la migración de células de cáncer a través de una barrera endotelial ⁵ o la tecnología eléctrica de la célula-sustrato Impedance Sensing (IEM) para controlar la interrupción en tiempo real de una monocapa endotelial intacta por las células cancerosas ^6. Estos ensayos suelen carecer de la dinámica de fluidos y los factores estromales que de otra manera afectar a la unión de células de cáncer a una pared endotelial. Este problema es algo eludirse mediante redes vasculares perfusable que surgen a partir del cultivo de endotelio 3D con el apoyo a las células del estroma, y estos sistemas de microfluidos 3D ahora representan la vanguardia de las actuales opciones in vitro ^7,8. Sin embargo, estos enfoques omiten el microambiente robusta de un sistema circulatorio funcionaly por lo tanto sólo en parte sustituto para los modelos in vivo.

El más ampliamente utilizado en el modelo in vivo de la invasión vascular es el ratón, en el cual ensayos de metástasis experimentales se realizan comúnmente debido a que ocurren en escalas de tiempo relativamente cortos y generalmente son indicativas de la capacidad metastásica ^9. Estos ensayos implican la inyección directa de células cancerosas en circulación y por lo tanto modelar las etapas finales de la metástasis, es decir, la extravasación de células cancerosas y colonización de órganos. Los ensayos de metástasis experimentales difieren según el lugar de la inyección de células de cáncer y en última instancia, los órganos analizados. En el primer tipo de ensayo, se inyectan células de cáncer en la vena caudal de los ratones y la siembra de células de cáncer en los pulmones se monitoriza ^10,11. El segundo ensayo implica la realización de inyecciones intracardiacas para dirigir la siembra metastásica hacia el microambiente de la médula ^12-14, sino también el cerebro ^15. En la tercera ensayo, cáncer de cells se inyectan en el bazo con el fin de permitir la colonización del hígado ¹⁶ mientras que la cuarta ruta de entrega en la arteria carótida transporta las células cancerosas en el cerebro ^17,18. Independientemente del método de entrega de células de cáncer, la colonización de órganos es el punto final experimental aceptado y se determina generalmente por medio de luminiscencia, histología, o técnicas basadas en PCR. A pesar de las ventajas fisiológicas de la realización de ensayos de metástasis experimentales dentro de un huésped murino, estos experimentos aún requieren semanas o meses para completar y analizar.

El modelo de pez cebra (Danio rerio) ha surgido recientemente como un nuevo sistema para estudiar la progresión del cáncer ^19,20, y permite la evaluación de la invasión vascular de células cancerosas dentro de un sistema circulatorio funcional sobre una escala de tiempo mucho más corto en comparación con los ratones ^21-24. El método utiliza una cepa de pez cebra transparente que tiene su endotelios etiquetadas con un arrecife de coral verde fluoreportero proteína rescent dirigido por el promotor kdrl, el receptor de pez cebra para el factor de crecimiento endotelial vascular ^25. En el ensayo, las células cancerosas se marcan con un marcador fluorescente rojo y se inyectan en el seno precardiaco de embriones de 2 días. En cualquier lugar entre 48 a 96 horas después de la inyección, las células cancerosas que han invadido fuera de la vasculatura y en la región caudal de embriones pueden ser marcados de manera eficiente en un microscopio de fluorescencia. Aquí aplicamos la técnica a un panel de líneas celulares de cáncer de mama humano comúnmente utilizados para demostrar grandes diferencias en su capacidad invasiva vascular. Además, se demuestra que el cambio de la zona de inyección al saco embrionario yema permite el estudio de las interacciones celulares heterogéneas, como las poblaciones celulares de cáncer pueden ser diferencialmente marcadas con colorantes fluorescentes y se inyectan en embriones de pez cebra que carecen de vasculatura fluorescente. En este último ensayo, las células cancerosas que han invadido la yema y intravasated en el vasculature se anotó en la región caudal de 24 a 48 horas después de la inyección. Debido a la eficacia y la comodidad de este modelo, el pez cebra se emplean cada vez más para probar rápidamente la capacidad invasiva vascular de las células cancerosas bajo un entorno fisiológico.

Protocol

Declaración de Ética: embriones de pez cebra fueron generados de acuerdo con un protocolo aprobado IACUC. Estos experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las recomendaciones del Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Georgetown. 1. Organizar embriones para inyección y crear stock Soluciones Generar larvas de pez cebra requisito para evaluar la invasión vascular de células de cáncer. Establecer por pares o grupos en forma cruzada de acoplamien…

Representative Results

Aquí hemos probado la capacidad invasiva vascular de líneas celulares de cáncer de mama comúnmente utilizados en un modelo de embrión de pez cebra (Figura 1). Se emplearon criterios rigurosos en la extravasación de puntuación para estas diferentes líneas celulares, donde los acontecimientos positivos sólo si se contaron las células cancerosas habían extravasado claramente, este ser hecho principalmente para limitar los positivos falsos que podrían derivarse d…

Discussion

Esta técnica utiliza el modelo de pez cebra para probar de manera eficiente la capacidad invasiva vascular de las células cancerosas (véase la Figura 1). A continuación se aplicó la técnica a un panel de líneas celulares de cáncer de mama con el fin de proporcionar una línea de base sobre la que otros investigadores pueden construir sus propios estudios (véase la Tabla 1. Las figuras 2 – 3). La observación de que MDA-MB-231 células fácilmente invadieron en …

Materials

0.05% Trypsin-EDTA	Life Technologies	25300-054
100mm Dishes	Corning Incorporated	3160-100
5 3/4" Disposable Pastur Pipets, borosilicate Glass	Fisher Brand	13-678-20B
60 mm Dish	Corning Incorporated	3160-60
Agarose, Low Melting	Fisher	BP165-25
Agarose, Molecular Grade	Bioline	BIO-41026
Capillary Glass, Standard, 1.2MM x 0.68MM, 4"	A-M Systems, Inc	627000
David Kopf 700C Vertical Pipette Puller	Hofstra Group	3600
DMEM	Life Technologies	11995-065
Electrode Storage Jar, 1.0MM	World Precision Instruments, Inc	E210
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine, MS-222)	Fluka	A5040
Eyelash Brush	Ted Pella, Inc	113
Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated	Omega Scientific	FB-12
Fisherbrand Transfer Pipettes	ThermoFisher Scientific	13-711-7M
Gel Loading Pipet Tips	Fisher Brand	02-707-181
Glass Bottom Dishes (12.0 mm)	ThermoFisher Scientific	150680
Glass Depression Slide	VWR	470005-634
Instant Ocean Salt, Sea Salt	Pentair	IS50
Latex Rubber Bulbs, 2mL, Pack of 72	Heathrow Scientific	HS20622B
SP8 Confocal Microscope	Leica
Micromanipulator	Narishige
Eclipse E600	Nikon
PBS	Life Technologies	10010-023
Penicillin-G Potassium	Fisher Biotech	BP914-100
Petri Plates, 100mm x 15mm	Fisher Brand	FB0875713
Picospritzer II	General Valve Corporation
RPMI 1640 Medium	Life Technologies	11875-093
Streptomycin Sulfate	Fisher Biotech	BP910-50
Vybrant DiI	ThermoFisher Scientific	V22885
Vybrant DiO	ThermoFisher Scientific	V22886
Zebrafish	Georgetown Zebrafish Shared Resources
Cell lines were maintained in DMEM + 10% FBS, with the expection of BT-474 and HCC18-6 cells, which were mantained in RPMI + 10% FBS.