Zebra balığı Kanser Hücrelerinin Vasküler İnvaziv Yetenek (Test<em> Danio rerio</em>)
Summary
Bu yöntem etkili bir kanser hücrelerinin damar invaziv yeteneğini test etmek zebrafish embriyolar kullanır. Floresan kanser hücrelerinin gelişmekte olan embriyo precardiac sinüs ve yumurta sarısı kesesinin içine enjekte edilir. Kanser hücresi vasküler invazyon ve damar dışına 24-96 saat sonra kuyruk bölgenin floresan mikroskobu ile değerlendirilir.
Abstract
Cancer cell vascular invasion and extravasation is a hallmark of metastatic progression. Traditional in vitro models of cancer cell invasion of endothelia typically lack the fluid dynamics that invading cells are otherwise exposed to in vivo. However, in vivo systems such as mouse models, though more physiologically relevant, require longer experimental timescales and present unique challenges associated with monitoring and data analysis. Here we describe a zebrafish assay that seeks to bridge this technical gap by allowing for the rapid assessment of cancer cell vascular invasion and extravasation. The approach involves injecting fluorescent cancer cells into the precardiac sinus of transparent 2-day old zebrafish embryos whose vasculature is marked by a contrasting fluorescent reporter. Following injection, the cancer cells must survive in circulation and subsequently extravasate from vessels into tissues in the caudal region of the embryo. Extravasated cancer cells are efficiently identified and scored in live embryos via fluorescence imaging at a fixed timepoint. This technique can be modified to study intravasation and/or competition amongst a heterogeneous mixture of cancer cells by changing the injection site to the yolk sac. Together, these methods can evaluate a hallmark behavior of cancer cells and help uncover mechanisms indicative of malignant progression to the metastatic phenotype.
Introduction
Metastatik hastalık kanser mortalite ve kanser hücresi yayılmasını sağlayabilmek 1 keşfedilmeyi beklemektedir birçok mekanizmalar önemli bir nedenidir. Başarıyla metastaz için bir kanser hücresi için, öncelikle dolaşım sistemi içine (intravasate) girin, primer tümörü çevreleyen stroma ile işgal gerekir, dolaşımdan transit çıkış (extravasate) hayatta ve son olarak uygulanabilir bir koloni kurmak uzak organ sitesinde 2'de. Intravasation ve damar dışına böylece metastatik kaskad önemli adımlardır, ancak her kanser hücresi bozarak ve endotel kavşaklar 3 ile göç de doğal olarak usta değildir. Aslında, kanser hücresi vasküler invazyonu çevreleyen ve işlem ayrıca iç ve dış faktörlerin 4 çeşitli etkilenebilir özel baskılar bir dizi bulunmaktadır. Bu nedenlerden dolayı, ileri evre kanser saldırgan davranış prob teknikleri genellikle v odaklanmakmetastatik yayılması tahmin etmek için bir araç olarak, invaziv yeteneği ascular.
Çeşitli model sistemler in vitro kanser hücresi vasküler invazyon çalışma kolaylaştırmak için vardır. En vitro deneylerde kullanılan kanser hücreleri 6 tarafından sağlam endotel tek tabaka gerçek zamanlı bozulmasını izlemek için bir endotel bariyer 5 ya da elektrik Hücre Yüzey empedansını algılayarak, (ECIS) teknolojisi ile kanser hücre göçü değerlendirmek ya Transwell sistemleri içerir. Bu tahliller, tipik aksi bir endotel duvara kanser hücresi eki etkileyecektir akışkanlar dinamiği ve stromal faktörleri yoksundur. Bu sorun biraz stromal hücreler destekleyen endotelinin 3D kültür kaynaklanan perfusable vasküler şebekeler tarafından atlatılabilir edilir ve bu 3 boyutlu mikroakışkan sistemleri artık vitro mevcut seçeneklerin 7,8 ön planda temsil etmektedir. Yine de, bu yaklaşımlar fonksiyonel dolaşım sisteminin sağlam mikro ihmalve bu nedenle sadece in vivo modeller için parça atama.
En yaygın olarak vasküler invazyon in vivo modelde kullanılan nispeten kısa zaman ölçeği üzerinde meydana gelir ve metastatik yeteneği 9 genellikle göstergesidir için deneysel metastaz tahlilleri sık gerçekleştirilen edildiği fare,. Bu deneyler dolaşıma kanser hücrelerinin direkt enjeksiyon içerir ve bu nedenle metastaz, organların yani ekstravazasyon ve kanser hücresi kolonizasyon son aşamalarını modeli. Deneysel metastaz tahlilleri kanser hücre enjeksiyon yerinde göre farklılık ve organlar sonuçta analiz edildi. İlk deney türü, kanser hücreleri akciğer fareler ve kanser hücresi tohumlama kuyruk damarının içine enjekte edilir 10,11 izlenir. İkinci tahlil kemik mikroçevresindeki 12-14 doğru metastatik tohumlama yönlendirmek için intrakardiyak enjeksiyon gerçekleştiren, fakat aynı zamanda beyin 15 içerir. Üçüncü bir deneyde, kanser Cıarşın karotid artere dördüncü dağıtım yolu, beyin 17,18 kanser hücreleri taşıyan ise karaciğer 16 kolonizasyonunu izin vermek amacıyla dalak içine enjekte edilir. Ne olursa olsun kanser hücresi teslim yönteminin organ kolonizasyonu kabul deneysel uç ve genellikle lüminesans, histoloji, ya da PCR tabanlı teknikleri ile tespit edilir. Bir fare konak içinde deneysel metastaz deneyleri yürüten fizyolojik avantajlarına rağmen, bu deneyler hala tamamlamak ve analiz etmek için aylar haftalar gerektirir.
Zebra balığı (Danio rerio) modeli son zamanlarda kanser ilerlemesini 19,20 incelemek için yeni bir sistem olarak ortaya çıktı ve fareler 21-24 ile karşılaştırıldığında çok daha kısa bir süreye üzerinde fonksiyonel dolaşım sistemi içinde kanser hücresi damar invazyonu değerlendirilmesi için olanak sağlamaktadır. yöntem, endotelin yeşil resif mercan fluo ile etiketlenmiş olan şeffaf zebrafish gerginlik kullanırkdrl promotör, vasküler endotelyal büyüme faktörü 25 zebrabalıkları reseptör tarafından yönlendirilen rescent protein muhabiri. tahlilde, kanser hücreleri, bir kırmızı floresan işaretleyici ile etiketlenir ve 2 günlük embriyoların precardiac sinüs içine enjekte edilir. Anywhere 48 saat 96 arasındaki enjeksiyondan sonra, damarsal dışında ve embriyoların kaudal bölgeye işgal etmiş kanser hücreleri bir floresan mikroskop verimli attı edilebilir. Burada da vasküler invaziv yeteneği açık farkları göstermek için yaygın olarak kullanılan insan göğüs kanseri hücre çizgileri panelinde tekniği uygulanır. Ayrıca, kanser hücre popülasyonları farklı olarak florasan boyalarla işaretlenmiş floresan damar yoksun zebra balığı embriyoların içine enjekte edilebilir embriyo yumurta sarısının için enjeksiyon yerinin değiştirilmesi, heterojen bir hücre etkileşimleri çalışma için izin verdiğini göstermektedir. Bu ikinci deneyde, sarısı işgal ve sahip kanser hücreleri vasculatur içine intravasatede enjeksiyonundan sonra 48 saat için kaudal bölgede 24 puanlanır. Nedeniyle bu modelin etkililiği ve kolaylık, zebra balığı giderek hızla fizyolojik bir ortamda altında kanser hücrelerinin damar invaziv kabiliyetini test etmek için kullanılır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu teknik, etkili bir şekilde, kanser hücreleri (Şekil 1 e bakınız) vasküler invaziv yeteneğini test etmek zebra balığı modeli kullanmaktadır. (; – 3 Şekil 2 Tablo 1) Burada diğer araştırmacılar daha sonra kendi çalışmalarını inşa edebilirsiniz hangi üzerine bir temel sağlamak amacıyla meme kanseri hücre hatları bir panel tekniği uygulandı. MDA-MB-231 hücreleri kolayca zebra balığı embriyolarının kaudal bölgeye işgal gözlem vasküle…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Peter Johnson of the Georgetown University Microscopy Core for assistance with imaging the zebrafish embryos. The Microscopy & Imaging Shared Resource and the Zebrafish Shared Resource are partially supported by NIH/NCI grant P30-CA051008. This work was also supported by NIH/NCI CA71508 (AW) and CA177466 (AW).
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| 100mm Dishes | Corning Incorporated | 3160-100 | |
| 5 3/4" Disposable Pastur Pipets, borosilicate Glass | Fisher Brand | 13-678-20B | |
| 60 mm Dish | Corning Incorporated | 3160-60 | |
| Agarose, Low Melting | Fisher | BP165-25 | |
| Agarose, Molecular Grade | Bioline | BIO-41026 | |
| Capillary Glass, Standard, 1.2MM x 0.68MM, 4" | A-M Systems, Inc | 627000 | |
| David Kopf 700C Vertical Pipette Puller | Hofstra Group | 3600 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | |
| Electrode Storage Jar, 1.0MM | World Precision Instruments, Inc | E210 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine, MS-222) | Fluka | A5040 | |
| Eyelash Brush | Ted Pella, Inc | 113 | |
| Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-12 | |
| Fisherbrand Transfer Pipettes | ThermoFisher Scientific | 13-711-7M | |
| Gel Loading Pipet Tips | Fisher Brand | 02-707-181 | |
| Glass Bottom Dishes (12.0 mm) | ThermoFisher Scientific | 150680 | |
| Glass Depression Slide | VWR | 470005-634 | |
| Instant Ocean Salt, Sea Salt | Pentair | IS50 | |
| Latex Rubber Bulbs, 2mL, Pack of 72 | Heathrow Scientific | HS20622B | |
| SP8 Confocal Microscope | Leica | ||
| Micromanipulator | Narishige | ||
| Eclipse E600 | Nikon | ||
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| Penicillin-G Potassium | Fisher Biotech | BP914-100 | |
| Petri Plates, 100mm x 15mm | Fisher Brand | FB0875713 | |
| Picospritzer II | General Valve Corporation | ||
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11875-093 | |
| Streptomycin Sulfate | Fisher Biotech | BP910-50 | |
| Vybrant DiI | ThermoFisher Scientific | V22885 | |
| Vybrant DiO | ThermoFisher Scientific | V22886 | |
| Zebrafish | Georgetown Zebrafish Shared Resources | ||
| Cell lines were maintained in DMEM + 10% FBS, with the expection of BT-474 and HCC18-6 cells, which were mantained in RPMI + 10% FBS. | |||
References
- Cummings, M. C., et al. Metastatic progression of breast cancer: insights from 50 years of autopsies. Am J Path. 232, 23-31 (2014).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massagué, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Reymond, N., d’Água, B. B., Ridley, A. J. Crossing the endothelial barrier during metastasis. Nat Rev Cancer. 13 (12), 858-870 (2013).
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nat Med. 19 (11), 1423-1437 (2013).
- Hooper, S., Marshall, J. F., Sahai, E. Tumor cell migration in three dimensions. Method Enzymol. 409, 625-642 (2006).
- Rahim, S., Üren, A. A real-time electrical impedance based technique to measure invasion of endothelial cell monolayer by cancer cells. J Vis Exp. (50), (2011).
- Jeon, J. S., et al. Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (1), 214-219 (2015).
- Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nat Protoc. 7 (7), 1247-1259 (2012).
- Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. Modelling breast cancer: one size does not fit all. Nat Rev Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).
- Mohanty, S., Xu, L. Experimental metastasis assay. J Vis Exp. (42), (2010).
- Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Nature. 436 (7050), 518-524 (2005).
- Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. Models of bone metastasis. J Vis Exp. (64), e4260 (2012).
- Arguello, F., Baggs, R. B., Frantz, C. N. A murine model of experimental metastasis to bone and bone marrow. Cancer Res. 48 (23), 6876-6881 (1988).
- Minn, A. J., et al. Distinct organ-specific metastatic potential of individual breast cancer cells and primary tumors. J Clin Invest. 115 (1), 44-55 (2005).
- Bos, P. D., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain. Nature. 459 (7249), 1005-1009 (2009).
- Soares, K. C., et al. A preclinical murine model of hepatic metastases. J Vis Exp. (91), e51677 (2014).
- Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nature Med. 16 (1), 116-122 (2010).
- Hasegawa, H., Ushio, Y., Hayakawa, T., Yamada, K., Mogami, H. Changes of the blood-brain barrier in experimental metastatic brain tumors. J Neurosurg. 59 (2), 304-310 (1983).
- Amatruda, J. F., Shepard, J. L., Stern, H. M., Zon, L. I. Zebrafish as a cancer model system. Cancer Cell. 1 (3), 229-231 (2002).
- Feitsma, H., Cuppen, E. Zebrafish as a cancer model. Molecular Cancer Res. 6 (5), 685-694 (2008).
- Stoletov, K., Klemke, R. Catch of the day: zebrafish as a human cancer model. Oncogene. 27 (33), 4509-4520 (2008).
- Stoletov, K., et al. Visualizing extravasation dynamics of metastatic tumor cells. J Cell Sci. 123 (13), 2332-2341 (2010).
- Kanada, M., Zhang, J., Yan, L., Sakurai, T., Terakawa, S. Endothelial cell-initiated extravasation of cancer cells visualized in zebrafish. PeerJ. , (2014).
- Teng, Y., Xie, X., Walker, S., White, D. T., Mumm, J. S., Cowell, J. K. Evaluating human cancer cell metastasis in zebrafish. BMC Cancer. 13 (453), (2013).
- Cross, L. M., Cook, M. A., Lin, S., Chen, J. -. N., Rubinstein, A. L. Rapid analysis of angiogenesis drugs in a live fluorescent zebrafish assay. Arterioscl Throm Vas. 23 (5), 911-912 (2003).
- Sharif, G. M., et al. Cell growth density modulates cancer cell vascular invasion via Hippo pathway activity and CXCR2 signaling. Oncogene. 34, 5879-5889 (2015).
- Novoa, B., Figueras, A. Zebrafish: model for the study of inflammation and the innate immune response to infectious diseases. Adv Exp Med Biol. 946, 253-275 (2012).
- Kitamura, T., Qian, B. -. Z., Pollard, J. W. Immune cell promotion of metastasis. Nature Rev Immunol. 15 (2), 73-86 (2015).
- He, S., et al. Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model. J Pathol. 227 (4), 431-445 (2012).
- Tulotta, C., et al. Inhibition of signaling between human CXCR4 and zebrafish ligands by the small molecule IT1t impairs the formation of triple-negative breast cancer early metastases in a zebrafish xenograft model. Dis Model Mech. 9 (2), 141-153 (2016).
- Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M. I., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. B. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
- Berens, E. B., et al. Keratin-associated protein 5-5 controls cytoskeletal function and cancer cell vascular invasion. Oncogene. , (2016).
