Teste Vaskulær Invasive Evne av kreftceller i Sebrafisk (<em> Danio rerio</em>)
Summary
Denne metoden benytter sebrafisk embryoer for effektivt å teste den vaskulære invasiv evne til kreftceller. Fluorescent kreftceller blir injisert i precardiac sinus eller plommesekken utviklings embryoer. Kreftcelle vaskulær invasjon og ekstravasering blir vurdert via fluorescens mikroskopi av halen området 24 til 96 timer senere.
Abstract
Cancer cell vascular invasion and extravasation is a hallmark of metastatic progression. Traditional in vitro models of cancer cell invasion of endothelia typically lack the fluid dynamics that invading cells are otherwise exposed to in vivo. However, in vivo systems such as mouse models, though more physiologically relevant, require longer experimental timescales and present unique challenges associated with monitoring and data analysis. Here we describe a zebrafish assay that seeks to bridge this technical gap by allowing for the rapid assessment of cancer cell vascular invasion and extravasation. The approach involves injecting fluorescent cancer cells into the precardiac sinus of transparent 2-day old zebrafish embryos whose vasculature is marked by a contrasting fluorescent reporter. Following injection, the cancer cells must survive in circulation and subsequently extravasate from vessels into tissues in the caudal region of the embryo. Extravasated cancer cells are efficiently identified and scored in live embryos via fluorescence imaging at a fixed timepoint. This technique can be modified to study intravasation and/or competition amongst a heterogeneous mixture of cancer cells by changing the injection site to the yolk sac. Together, these methods can evaluate a hallmark behavior of cancer cells and help uncover mechanisms indicative of malignant progression to the metastatic phenotype.
Introduction
Metastatisk sykdom er en vesentlig årsak til kreft dødelighet og mange mekanismer som gjør kreftcelle formidling gjenstår å bli oppdaget en. For at en kreftcelle for å kunne spre, må det først invadere gjennom stroma som omgir en primærtumor, skriv (intravasate) i sirkulasjonssystemet, overleve i transitt, exit (ekstravasere) fra sirkulasjonen, og til slutt etablere en levedyktig koloni på den fjerne organ for 2.. Intravasation og bloduttredelse er dermed avgjørende skritt i metastatisk cascade, men hver kreftcelle er ikke iboende flinke til å forstyrre og migrere gjennom endothelial veikryss 3. Faktisk er det en rekke unike seleksjonstrykk som omgir kreftcelle vaskulær invasjon og fremgangsmåten kan videre påvirkes av en rekke endogene og eksogene fire faktorer. Av disse grunner teknikker som tester den aggressive oppførselen til avansert stadium kreften ofte fokus på vascular invasiv evne som et middel til å forutsi metastatisk spredning.
Ulike modellsystemer eksisterer for å legge til rette studiet av kreft celle vaskulær invasjon in vitro. Den mest benyttede in vitro-analyser innebære enten Transwell-systemer for å vurdere kreftcellemigrering gjennom en endotelial barriere 5 eller elektrisk celle-substrat Impedans Sensing (ECIS) teknologi for å overvåke i sanntid avbrudd av en intakt endotel-monolag av kreftceller 6. Disse analyser mangler vanligvis den væskedynamikk og stromale faktorer som ellers ville påvirke kreftcellebinding til en endotelial vegg. Dette problemet er noe omgått ved perfusable vaskulære nettverk som oppstår fra 3D-kulturen i endothelia med støtte stromale celler, og disse 3D microfluidic systemer representerer nå i forkant av dagens in vitro alternativer 7,8. Likevel, disse metodene utelate robust mikromiljøet av en funksjonell sirkulasjonssystemetog derfor bare delvis erstatning for in vivo-modeller.
Den mest brukte in vivo modell av vaskulær invasjon er musa, hvori eksperimentelle metastase analysene er vanligvis utføres fordi de forekommer i forholdsvis korte tidsrammer, og er generelt et tegn på metastatisk evne 9. Disse analyser innebære direkte injeksjon av kreftceller i omløp og derfor modellere slutten stadier av metastasering, nemlig ekstravasasjon og kreftcelle kolonisering av organer. De eksperimentelle metastase analyser variere basert på tuftene av kreftcelle injeksjon og organene til slutt analysert. I det første analysetype, blir kreftceller injisert inn i halevenen til mus og kreftcelle seeding i lungene overvåkes 10,11. Den andre analysen innebærer utførelse intrakardielle injeksjoner for å lede metastatisk seeding mot benet mikromiljøet 12-14, men også hjernen 15. I den tredje analysen, kreft calen blir injisert inn i milten for å tillate kolonisering av leveren 16, mens den fjerde leveringsruten inn i karotidarterien bærer kreftceller i hjernen 17,18. Uavhengig av kreftcellen leveringsmåte, er organ kolonisering akseptert eksperimentelle endepunktet og er generelt bestemmes via luminescens, histologi, eller PCR-baserte teknikker. Til tross for de fysiologiske fordelene ved å drive eksperimentell metastase analyser innenfor en muse vert, disse eksperimentene fortsatt kreve uker til måneder å fullføre og analysere.
Sebrafisk (Danio rerio) modellen har nylig dukket opp som et nytt system for å studere kreft progresjon 19,20, og åpner for vurdering av kreftcellen vaskulær invasjon innenfor en funksjonell sirkulasjonssystemet over en mye kortere tidsskala sammenlignet med mus 21-24. Metoden benytter en gjennomsiktig sebrafisk stamme som har sin endothelia merket med en grønn rev korall fluorescent protein reporter drevet av kdrl promoter, sebrafisk reseptor for vaskulær endotelial vekstfaktor 25. I analysen blir kreftceller merket med et rødt fluorescerende markør og injisert i precardiac sinus av to dager gamle embryoer. Hvor som helst mellom 48 til 96 timer etter injeksjonen, kan kreftceller som har invadert ut av vaskulaturen og inn i den caudale området av embryoer scores effektivt på et fluorescerende mikroskop. Her kan vi bruke teknikken til et panel av vanlig anvendte humane brystcancercellelinjer for å demonstrere sterk forskjeller i deres vaskulære invasive egenskaper. Videre demonstrerer vi at ved å endre injeksjonsstedet til embryoet plommesekken tillater studiet av heterogene celleinteraksjoner, som cancercellepopulasjoner kan differensielt merket med fluorescerende fargestoffer og injisert i sebrafisk embryoer mangler fluorescerende vaskulatur. I denne sistnevnte analyse, har kreftceller som har invadert den eggeplomme og intravasated inn i vasculature blir scoret i hale regionen 24-48 timer etter injeksjon. På grunn av effektiviteten og bekvemmeligheten av denne modellen, er sebrafisk stadig ansatt for å raskt teste vascular invasiv evne til kreftceller under en fysiologisk innstilling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne teknikken utnytter sebrafisk modell for effektivt å teste den vaskulære invasiv evnen av kreftceller (se figur 1). Her påføres vi teknikken til et panel av brystkreftcellelinjer for å tilveiebringe en grunnlinje på hvilken andre forskere kan deretter bygge sine egne studier (se tabell 1; figurer 2 – 3). Den observasjon at MDA-MB-231-celler lett invaderte inn i den caudale området av sebrafisk embryoer ville gjøre denne cellelinjen ideell for testing av mid…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Peter Johnson of the Georgetown University Microscopy Core for assistance with imaging the zebrafish embryos. The Microscopy & Imaging Shared Resource and the Zebrafish Shared Resource are partially supported by NIH/NCI grant P30-CA051008. This work was also supported by NIH/NCI CA71508 (AW) and CA177466 (AW).
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| 100mm Dishes | Corning Incorporated | 3160-100 | |
| 5 3/4" Disposable Pastur Pipets, borosilicate Glass | Fisher Brand | 13-678-20B | |
| 60 mm Dish | Corning Incorporated | 3160-60 | |
| Agarose, Low Melting | Fisher | BP165-25 | |
| Agarose, Molecular Grade | Bioline | BIO-41026 | |
| Capillary Glass, Standard, 1.2MM x 0.68MM, 4" | A-M Systems, Inc | 627000 | |
| David Kopf 700C Vertical Pipette Puller | Hofstra Group | 3600 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | |
| Electrode Storage Jar, 1.0MM | World Precision Instruments, Inc | E210 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine, MS-222) | Fluka | A5040 | |
| Eyelash Brush | Ted Pella, Inc | 113 | |
| Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-12 | |
| Fisherbrand Transfer Pipettes | ThermoFisher Scientific | 13-711-7M | |
| Gel Loading Pipet Tips | Fisher Brand | 02-707-181 | |
| Glass Bottom Dishes (12.0 mm) | ThermoFisher Scientific | 150680 | |
| Glass Depression Slide | VWR | 470005-634 | |
| Instant Ocean Salt, Sea Salt | Pentair | IS50 | |
| Latex Rubber Bulbs, 2mL, Pack of 72 | Heathrow Scientific | HS20622B | |
| SP8 Confocal Microscope | Leica | ||
| Micromanipulator | Narishige | ||
| Eclipse E600 | Nikon | ||
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| Penicillin-G Potassium | Fisher Biotech | BP914-100 | |
| Petri Plates, 100mm x 15mm | Fisher Brand | FB0875713 | |
| Picospritzer II | General Valve Corporation | ||
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11875-093 | |
| Streptomycin Sulfate | Fisher Biotech | BP910-50 | |
| Vybrant DiI | ThermoFisher Scientific | V22885 | |
| Vybrant DiO | ThermoFisher Scientific | V22886 | |
| Zebrafish | Georgetown Zebrafish Shared Resources | ||
| Cell lines were maintained in DMEM + 10% FBS, with the expection of BT-474 and HCC18-6 cells, which were mantained in RPMI + 10% FBS. | |||
References
- Cummings, M. C., et al. Metastatic progression of breast cancer: insights from 50 years of autopsies. Am J Path. 232, 23-31 (2014).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massagué, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Reymond, N., d’Água, B. B., Ridley, A. J. Crossing the endothelial barrier during metastasis. Nat Rev Cancer. 13 (12), 858-870 (2013).
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nat Med. 19 (11), 1423-1437 (2013).
- Hooper, S., Marshall, J. F., Sahai, E. Tumor cell migration in three dimensions. Method Enzymol. 409, 625-642 (2006).
- Rahim, S., Üren, A. A real-time electrical impedance based technique to measure invasion of endothelial cell monolayer by cancer cells. J Vis Exp. (50), (2011).
- Jeon, J. S., et al. Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (1), 214-219 (2015).
- Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nat Protoc. 7 (7), 1247-1259 (2012).
- Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. Modelling breast cancer: one size does not fit all. Nat Rev Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).
- Mohanty, S., Xu, L. Experimental metastasis assay. J Vis Exp. (42), (2010).
- Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Nature. 436 (7050), 518-524 (2005).
- Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. Models of bone metastasis. J Vis Exp. (64), e4260 (2012).
- Arguello, F., Baggs, R. B., Frantz, C. N. A murine model of experimental metastasis to bone and bone marrow. Cancer Res. 48 (23), 6876-6881 (1988).
- Minn, A. J., et al. Distinct organ-specific metastatic potential of individual breast cancer cells and primary tumors. J Clin Invest. 115 (1), 44-55 (2005).
- Bos, P. D., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain. Nature. 459 (7249), 1005-1009 (2009).
- Soares, K. C., et al. A preclinical murine model of hepatic metastases. J Vis Exp. (91), e51677 (2014).
- Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nature Med. 16 (1), 116-122 (2010).
- Hasegawa, H., Ushio, Y., Hayakawa, T., Yamada, K., Mogami, H. Changes of the blood-brain barrier in experimental metastatic brain tumors. J Neurosurg. 59 (2), 304-310 (1983).
- Amatruda, J. F., Shepard, J. L., Stern, H. M., Zon, L. I. Zebrafish as a cancer model system. Cancer Cell. 1 (3), 229-231 (2002).
- Feitsma, H., Cuppen, E. Zebrafish as a cancer model. Molecular Cancer Res. 6 (5), 685-694 (2008).
- Stoletov, K., Klemke, R. Catch of the day: zebrafish as a human cancer model. Oncogene. 27 (33), 4509-4520 (2008).
- Stoletov, K., et al. Visualizing extravasation dynamics of metastatic tumor cells. J Cell Sci. 123 (13), 2332-2341 (2010).
- Kanada, M., Zhang, J., Yan, L., Sakurai, T., Terakawa, S. Endothelial cell-initiated extravasation of cancer cells visualized in zebrafish. PeerJ. , (2014).
- Teng, Y., Xie, X., Walker, S., White, D. T., Mumm, J. S., Cowell, J. K. Evaluating human cancer cell metastasis in zebrafish. BMC Cancer. 13 (453), (2013).
- Cross, L. M., Cook, M. A., Lin, S., Chen, J. -. N., Rubinstein, A. L. Rapid analysis of angiogenesis drugs in a live fluorescent zebrafish assay. Arterioscl Throm Vas. 23 (5), 911-912 (2003).
- Sharif, G. M., et al. Cell growth density modulates cancer cell vascular invasion via Hippo pathway activity and CXCR2 signaling. Oncogene. 34, 5879-5889 (2015).
- Novoa, B., Figueras, A. Zebrafish: model for the study of inflammation and the innate immune response to infectious diseases. Adv Exp Med Biol. 946, 253-275 (2012).
- Kitamura, T., Qian, B. -. Z., Pollard, J. W. Immune cell promotion of metastasis. Nature Rev Immunol. 15 (2), 73-86 (2015).
- He, S., et al. Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model. J Pathol. 227 (4), 431-445 (2012).
- Tulotta, C., et al. Inhibition of signaling between human CXCR4 and zebrafish ligands by the small molecule IT1t impairs the formation of triple-negative breast cancer early metastases in a zebrafish xenograft model. Dis Model Mech. 9 (2), 141-153 (2016).
- Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M. I., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. B. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
- Berens, E. B., et al. Keratin-associated protein 5-5 controls cytoskeletal function and cancer cell vascular invasion. Oncogene. , (2016).
