جمع Serum- وخالية من تغذية الفأر الجنينية الجذعية المتوسطة مكيفة الخليوي لنهج خالية من خلية
Summary
يوفر هذا البروتوكول طريقة لجمع الخلايا الجذعية الجنينية الماوس (مسك) المتوسطة -conditioned (مسك-CM) المستمدة من مصل الدم (مصل الجنين البقري، FBS) – والمغذية (الخلايا الليفية الجنينية الماوس، MEFS) شروط خالية للخلية نهج خالية. قد تكون قابلة للتطبيق لعلاج الشيخوخة والأمراض المرتبطة بالشيخوخة.
Abstract
The capacity of embryonic stem cells (ESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs) to generate various cell types has opened new avenues in the field of regenerative medicine. However, despite their benefits, the tumorigenic potential of ESCs and iPSCs has long been a barrier for clinical applications. Interestingly, it has been shown that ESCs produce several soluble factors that can promote tissue regeneration and delay cellular aging, suggesting that ESCs and iPSCs can also be utilized as a cell-free intervention method. Therefore, the method for harvesting mouse embryonic stem cell (mESC)-conditioned medium (mESC-CM) with minimal contamination of serum components (fetal bovine serum, FBS) and feeder cells (mouse embryonic fibroblasts, MEFs) has been highly demanded. Here, the present study demonstrates an optimized method for the collection of mESC-CM under serum- and feeder-free conditions and for the characterization of mESC-CM using senescence-associated multiple readouts. This protocol will provide a method to collect pure mESC-specific secretory factors without serum and feeder contamination.
Introduction
والهدف من هذا البروتوكول هو جمع الماوس الجنينية الخلايا الجذعية (مسك) -conditioned المتوسطة (مسك-CM) من شروط الثقافة serum- وخالية من تغذية ولتوصيف الوظائف البيولوجية.
بشكل عام، والخلايا الجذعية الجنينية (المجالس الاقتصادية والاجتماعية) لديها إمكانات كبيرة للطب التجديدي والعلاج بالخلايا نظرا لتعدد القدرات والقدرة على التجديد الذاتي 1-3. ومع ذلك، فإن زرع المباشر للخلايا الجذعية لديها العديد من القيود، مثل الرفض المناعي، وتشكيل الورم 4،5. ولذلك، فإن نهج خالية من الخلايا قد يقدم استراتيجية علاجية بديلة للطب التجديدي والتدخلات الشيخوخة 6،7.
وينظر الشيخوخة باعتبارها نظيره الخلوي إلى شيخوخة الأنسجة والأعضاء، وتتميز حالة دائمة من اعتقال النمو، علم وظائف الأعضاء خلية تغير، والسلوكيات. الشيخوخة هي عامل الخطر الرئيسي للأمراض السائدة بما في ذلك السرطان وأمراض القلب والأوعية الدموية، رYPE 2 من داء السكري، والتنكس العصبي 8. واحدة من خصائص واضحة من الشيخوخة هو انخفاض في القدرة على التجدد الأنسجة، الذي ينجم عن شيخوخة الخلايا الجذعية والإرهاق 9. وقد أظهرت العديد من الدراسات الهامة الجزيئات الدوائية، مثل rapamycin 9، ريسفيراترول 10، والميتفورمين 11، والعوامل النظامية التي تنتقل عن طريق الدم، وهي GDF11 12، التي لديها القدرة على تأخير الشيخوخة باستمرار وتمديد فترة الحياة.
في هذه الدراسة، وقد تم حصادها مسك-CM دون المصل (الجنين المصل البقري، FBS) والتغذية (الماوس الجنينية الخلايا الليفية، MEFS) طبقات استبعاد التلوث من العوامل في الدم وعوامل إفرازية من MEFS. هذه الشروط السماح لCM serum- وخالية من التغذية التي بالتالي تمكين تحديد دقيق للعوامل إفرازية مسك محددة.
هذا البروتوكول المقترح كفاءة عالية، وتكلفة نسبيا فعالة، وسهلةليشغل. توفر هذه التقنية نظرة ثاقبة لتوصيف العوامل القابلة للذوبان المستمدة مسك التي يمكن أن توسط له تأثير مضاد للشيخوخة، والتي يمكن استخدامها لتطوير نهج علاجي آمن ويحتمل أن تكون مفيدة خالية من الخلايا تجاه التدخلات من أجل المرتبط بالشيخوخة الأمراض وغيرها من التجدد العلاجات.
Protocol
Representative Results
Discussion
لنجاح جمع serum- ومسك-CM خالية المغذية، ينبغي أن تؤخذ في الاقتراحات التالية بعين الاعتبار. العامل الأكثر أهمية هو استخدام mESCs مرور وقت مبكر لجمع مسك-CM. سابقا، وقد تبين أن مرور وقت مبكر مسك-CM له تأثيرات مضادة للشيخوخة أفضل مقارنة mESCs مرور في وقت متأخر. وقد تم الإبلاغ عن عدد م…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا البحث من قبل برنامج العلوم الاساسية بحوث (2013R1A1A2060930) وبرنامج مركز الأبحاث الطبية (2015R1A5A2009124) من خلال مؤسسة البحوث الوطنية لكوريا (جبهة الخلاص الوطني)، بتمويل من وزارة العلوم وتكنولوجيا المعلومات والاتصالات، والتخطيط المستقبلي. ويدعم هذا البحث أيضا قبل البدء غرانت التشغيل من مستشفى الأطفال المرضى (هونج كونج سونغ). ونود أن نشكر لورا BARWELL وسارة شبيبة كيم لمساعدة ممتازة في تحرير هذه المخطوطة والدكتور اندراس ناجي عن توفير خط G4 مسك.
Materials
| DMEM | Invitrogen | #11960-044 | |
| FBS | Invitrogen | #30044333 | 20%, ES cell quality |
| Penicillin and streptomycin | Invitrogen | #15140 | 50units/ml penicillin and 50mg/ml strepto |
| -mycin. | |||
| L-glutamine | Invitrogen | #25030 | 2mM |
| Nonessential amino acids (NEAA) | Invitrogen | #11140 | 100uM |
| β-mercaptoethanol | Sigma | #M3148 | 100uM |
| Leukemia inhibitory factor | Millipore | #ESG1107 | 100units/ml |
| OPTI-MEM | Invitrogen | #22600 | |
| X-gal | Sigma | #B4252 | 1mg/ml |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | 3.70% |
| Dimethylformamide (DMF) | Sigma | #D4551 | |
| Potassium ferricyanide | Aldrich | #455946 | 5mM |
| potassium ferrocyanide | Aldrich | #455989 | 5mM |
| NaCl | Sigma | #S7653 | 150mM |
| MgCl2 | Sigma | #M2393 | 2mM |
| Mytomycin C | Sigma | #M4287 | 10ug/ml |
| Propidium iodide | Sigma | #P4170 | 50ug/ml |
| TRIzol | Ambion | #15596018 | |
| M-MLV reverse transcript-tase | Promega | #M170B | |
| Power SYBR Green PCR master mix | Applied Biosystems | #4367659 | |
| HDFs, NHDF-Ad-Der-Fibroblast | LONZA | #CC-2511 | |
| Bottle top filter, | Corning | #430513 | 0.2μm |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Lavasani, M., et al. Muscle-derived stem/progenitor cell dysfunction limits healthspan and lifespan in a murine progeria model. Nat Commun. 3, 608 (2012).
- Woo, D. H., et al. Direct and indirect contribution of human embryonic stem cell-derived hepatocyte-like cells to liver repair in mice. Gastroenterology. 142, 602-611 (2012).
- Lee, A. S., Tang, C., Rao, M. S., Weissman, I. L., Wu, J. C. Tumorigenicity as a clinical hurdle for pluripotent stem cell therapies. Nat Med. 19, 998-1004 (2013).
- Moon, S. H., et al. A system for treating ischemic disease using human embryonic stem cell-derived endothelial cells without direct incorporation. Biomaterials. 32, 6445-6455 (2011).
- Tongers, J., Roncalli, J. G., Losordo, D. W. Therapeutic angiogenesis for critical limb ischemia: microvascular therapies coming of age. Circulation. 118, 9-16 (2008).
- Lazarous, D. F., et al. Basic fibroblast growth factor in patients with intermittent claudication: results of a phase I trial. J Am Coll Cardiol. 36, 1239-1244 (2000).
- Adams, P. D. Healing and hurting: molecular mechanisms, functions, and pathologies of cellular senescence. Mol Cell. 36, 2-14 (2009).
- Harrison, D. E., et al. Rapamycin fed late in life extends lifespan in genetically heterogeneous mice. Nature. 460, 392-395 (2009).
- Baur, J. A., Ungvari, Z., Minor, R. K., Le Couteur, D. G., de Cabo, R. Are sirtuins viable targets for improving healthspan and lifespan. Nat Rev Drug Discov. 11, 443-461 (2012).
- Martin-Montalvo, A., et al. Metformin improves healthspan and lifespan in mice. Nat Commun. 4, 2192 (2013).
- Loffredo, F. S., et al. Growth differentiation factor 11 is a circulating factor that reverses age-related cardiac hypertrophy. Cell. 153, 828-839 (2013).
- Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. , (2012).
- Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4, 1798-1806 (2009).
- Bae, Y. U., Choi, J. H., Nagy, A., Sung, H. K., Kim, J. R. Antisenescence effect of mouse embryonic stem cell conditioned medium through a PDGF/FGF pathway. FASEB J. 30, 1276-1286 (2016).
- Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90, 8424-8428 (1993).
- Li, X. Y., et al. Passage number affects the pluripotency of mouse embryonic stem cells as judged by tetraploid embryo aggregation. Cell Tissue Res. 327, 607-614 (2007).
- Mbeunkui, F., Fodstad, O., Pannell, L. K. Secretory protein enrichment and analysis: an optimized approach applied on cancer cell lines using 2D LC-MS/MS. J Proteome Res. 5, 899-906 (2006).
- Makridakis, M., Vlahou, A. Secretome proteomics for discovery of cancer biomarkers. J Proteomics. 73, 2291-2305 (2010).
- Kim, K. S., et al. Regulation of replicative senescence by insulin-like growth factor-binding protein 3 in human umbilical vein endothelial cells. Aging Cell. 6, 535-545 (2007).
- Kim, K. S., et al. Induction of cellular senescence by insulin-like growth factor binding protein-5 through a p53-dependent mechanism. Mol Biol Cell. 18, 4543-4552 (2007).
- Eiselleova, L., et al. Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells. Int J Dev Biol. 52, 353-363 (2008).
