Summary

Коллекция Serum- и фидерных свободной эмбриональных стволовых клеток мыши-кондиционированная среда для подхода бесклеточный

Published: January 08, 2017
doi:

Summary

Этот протокол обеспечивает способ сбора эмбриональных стволовых клеток мыши (МЕСК) -conditioned среда (МЕСК-СМ), полученные из сыворотки (эмбриональной бычьей сыворотки, ФБС) – и фидерные (мышиные эмбриональные фибробласты, MEFs) -свободных условия для ячейки -бесплатно подход. Это может быть применимо для лечения старения и возрастного заболеваний.

Abstract

The capacity of embryonic stem cells (ESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs) to generate various cell types has opened new avenues in the field of regenerative medicine. However, despite their benefits, the tumorigenic potential of ESCs and iPSCs has long been a barrier for clinical applications. Interestingly, it has been shown that ESCs produce several soluble factors that can promote tissue regeneration and delay cellular aging, suggesting that ESCs and iPSCs can also be utilized as a cell-free intervention method. Therefore, the method for harvesting mouse embryonic stem cell (mESC)-conditioned medium (mESC-CM) with minimal contamination of serum components (fetal bovine serum, FBS) and feeder cells (mouse embryonic fibroblasts, MEFs) has been highly demanded. Here, the present study demonstrates an optimized method for the collection of mESC-CM under serum- and feeder-free conditions and for the characterization of mESC-CM using senescence-associated multiple readouts. This protocol will provide a method to collect pure mESC-specific secretory factors without serum and feeder contamination.

Introduction

Целью этого протокола является сбор эмбриональных стволовых клеток мыши (MESC) -conditioned среды (MESC-CM) из serum- и фидерных свободных условиях культивирования и охарактеризовать его биологические функции.

В общем, эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) имеют большой потенциал для регенеративной медицины и клеточной терапии в связи с их плюрипотентности и способность к самообновлению 1-3. Тем не менее, прямая трансплантация стволовых клеток имеет ряд ограничений, например, иммунного отторжения и образования опухолей 4,5. Таким образом, подход бесклеточная может обеспечить альтернативную терапевтическую стратегию для восстановительной медицины и старения вмешательств 6,7.

Старение рассматривается как сотовый аналог старения тканей и органов, характеризующееся постоянным состоянием остановки роста, измененной физиологии клеток и поведения. Старение является основным фактором риска для распространенных заболеваний, включая рак, сердечно-сосудистые заболевания, тYpe диабет 2, и нейродегенеративные 8. Одним из очевидных признаков старения является снижение регенеративного потенциала тканей, которое вызвано старением стволовых клеток и истощение 9. Многие значительные исследования показали фармакологическую молекулы, такие как рапамицин 9, ресвератрол 10 и метформина 11 и системных факторов , переносимых с кровью, а именно GDF11 12, которые имеют возможность последовательно задерживать старение и увеличить продолжительность срока службы.

В настоящем исследовании, MESC-СМ был собран без сыворотки (эмбриональной телячьей сыворотки, FBS) и фидер (эмбриональных фибробластов мыши, МЭФ) слоев, чтобы исключить загрязнение факторов в сыворотке крови и секреторных факторов из MEFs. Эти условия позволили для serum- и фидерной свободной СМ, что, следовательно, позволило точно идентифицировать MESC специфических секреторных факторов.

Этот предложенный протокол является высокоэффективным, относительно экономически эффективным и легкодействовать. Этот метод дает представление о характеристике МЕСК полученных из растворимых факторов, которые могут опосредовать противоопухолевый эффект старения, который может быть использован для разработки безопасной и потенциально выгодного бесклеточной терапевтического подхода к вмешательствах по причине старения заболеваний, ассоциированных и других восстановительно лечения.

Protocol

Примечание: Схема на serum- и фидерных свободный протокол сбора CM показан на рисунке 1. 1. Материалы (Получение MEFs, Medium, тарелки, и решения) Приготовьте 500 мл среды для культивирования MEFs. Дополнение модифицированную Dilbecco среду Eagle (DMEM) с добавлением 10% FBS (качество ESC), 50 ед / м?…

Representative Results

Первоначально mESCs поддерживаются на MEF фидера в MESC среде с FBS и другими добавками (Фигуры 1А и 2А). CM была собрана из mESCs в Reduced Serum СМИ без фидерного слоя, FBS или других добавок (Фигуры 1В и 2В). Это состояние культуры позволяет нам собирать …

Discussion

Для успешного сбора serum- и фидерных свободного MESC-CM, следующие предложения должны быть приняты во внимание. Наиболее важным фактором является то, используя ранние прохождение mESCs для сбора MESC-CM. Ранее было показано, что раннее прохождение MESC-CM имеет лучшие омолаживающие эффекты по сравн?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Это исследование было поддержано Программой фундаментальных исследований (Science 2013R1A1A2060930) и Научно-исследовательский центр медицинской программы (2015R1A5A2009124) в рамках Национального исследовательского фонда Кореи (СРН), финансируемого Министерством науки, ИКТ и будущего планирования. Это исследование также поддерживается начинающей операционный грант из больницы для больных детей (HK Sung). Мы хотели бы поблагодарить Лору Barwell и Сара JS Ким за отличную помощь в редактировании рукописи и д-р Андраш Надь для обеспечения линии G4 MESC.

Materials

DMEM Invitrogen #11960-044
FBS Invitrogen #30044333 20%, ES cell quality
Penicillin and streptomycin  Invitrogen #15140 50units/ml penicillin and 50mg/ml strepto
-mycin.
L-glutamine  Invitrogen #25030 2mM
Nonessential amino acids (NEAA)  Invitrogen #11140 100uM
β-mercaptoethanol  Sigma #M3148 100uM
Leukemia inhibitory factor  Millipore #ESG1107 100units/ml
OPTI-MEM Invitrogen #22600
X-gal  Sigma #B4252 1mg/ml
Paraformaldehyde (PFA) Sigma P6148 3.70%
Dimethylformamide (DMF) Sigma #D4551
Potassium ferricyanide  Aldrich #455946 5mM
potassium ferrocyanide  Aldrich #455989 5mM
NaCl  Sigma #S7653 150mM
MgCl Sigma #M2393 2mM
Mytomycin C  Sigma #M4287 10ug/ml
Propidium iodide  Sigma #P4170 50ug/ml
TRIzol Ambion #15596018
M-MLV reverse transcript-tase Promega #M170B
Power SYBR Green PCR master mix  Applied Biosystems #4367659
HDFs, NHDF-Ad-Der-Fibroblast  LONZA #CC-2511
Bottle top filter,  Corning #430513 0.2μm

References

  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  2. Lavasani, M., et al. Muscle-derived stem/progenitor cell dysfunction limits healthspan and lifespan in a murine progeria model. Nat Commun. 3, 608 (2012).
  3. Woo, D. H., et al. Direct and indirect contribution of human embryonic stem cell-derived hepatocyte-like cells to liver repair in mice. Gastroenterology. 142, 602-611 (2012).
  4. Lee, A. S., Tang, C., Rao, M. S., Weissman, I. L., Wu, J. C. Tumorigenicity as a clinical hurdle for pluripotent stem cell therapies. Nat Med. 19, 998-1004 (2013).
  5. Moon, S. H., et al. A system for treating ischemic disease using human embryonic stem cell-derived endothelial cells without direct incorporation. Biomaterials. 32, 6445-6455 (2011).
  6. Tongers, J., Roncalli, J. G., Losordo, D. W. Therapeutic angiogenesis for critical limb ischemia: microvascular therapies coming of age. Circulation. 118, 9-16 (2008).
  7. Lazarous, D. F., et al. Basic fibroblast growth factor in patients with intermittent claudication: results of a phase I trial. J Am Coll Cardiol. 36, 1239-1244 (2000).
  8. Adams, P. D. Healing and hurting: molecular mechanisms, functions, and pathologies of cellular senescence. Mol Cell. 36, 2-14 (2009).
  9. Harrison, D. E., et al. Rapamycin fed late in life extends lifespan in genetically heterogeneous mice. Nature. 460, 392-395 (2009).
  10. Baur, J. A., Ungvari, Z., Minor, R. K., Le Couteur, D. G., de Cabo, R. Are sirtuins viable targets for improving healthspan and lifespan. Nat Rev Drug Discov. 11, 443-461 (2012).
  11. Martin-Montalvo, A., et al. Metformin improves healthspan and lifespan in mice. Nat Commun. 4, 2192 (2013).
  12. Loffredo, F. S., et al. Growth differentiation factor 11 is a circulating factor that reverses age-related cardiac hypertrophy. Cell. 153, 828-839 (2013).
  13. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. , (2012).
  14. Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4, 1798-1806 (2009).
  15. Bae, Y. U., Choi, J. H., Nagy, A., Sung, H. K., Kim, J. R. Antisenescence effect of mouse embryonic stem cell conditioned medium through a PDGF/FGF pathway. FASEB J. 30, 1276-1286 (2016).
  16. Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90, 8424-8428 (1993).
  17. Li, X. Y., et al. Passage number affects the pluripotency of mouse embryonic stem cells as judged by tetraploid embryo aggregation. Cell Tissue Res. 327, 607-614 (2007).
  18. Mbeunkui, F., Fodstad, O., Pannell, L. K. Secretory protein enrichment and analysis: an optimized approach applied on cancer cell lines using 2D LC-MS/MS. J Proteome Res. 5, 899-906 (2006).
  19. Makridakis, M., Vlahou, A. Secretome proteomics for discovery of cancer biomarkers. J Proteomics. 73, 2291-2305 (2010).
  20. Kim, K. S., et al. Regulation of replicative senescence by insulin-like growth factor-binding protein 3 in human umbilical vein endothelial cells. Aging Cell. 6, 535-545 (2007).
  21. Kim, K. S., et al. Induction of cellular senescence by insulin-like growth factor binding protein-5 through a p53-dependent mechanism. Mol Biol Cell. 18, 4543-4552 (2007).
  22. Eiselleova, L., et al. Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells. Int J Dev Biol. 52, 353-363 (2008).

Play Video

Cite This Article
Bae, Y., Sung, H., Kim, J. Collection of Serum- and Feeder-free Mouse Embryonic Stem Cell-conditioned Medium for a Cell-free Approach. J. Vis. Exp. (119), e55035, doi:10.3791/55035 (2017).

View Video