Coleção de sérica e sem Alimentador rato-tronco embrionárias Médio condicionado celular para uma abordagem livre de celular
Summary
Este protocolo proporciona um método para a recolha de células estaminais embrionárias de rato (MESC) forma climatizados, (MESC-CM) derivado de soro (soro fetal de bovino, FBS) – e do alimentador (fibroblastos embrionários de ratinho, MEFs) Livres de condições para uma célula abordagem -livre. Pode ser aplicável para o tratamento do envelhecimento e das doenças associadas ao envelhecimento.
Abstract
The capacity of embryonic stem cells (ESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs) to generate various cell types has opened new avenues in the field of regenerative medicine. However, despite their benefits, the tumorigenic potential of ESCs and iPSCs has long been a barrier for clinical applications. Interestingly, it has been shown that ESCs produce several soluble factors that can promote tissue regeneration and delay cellular aging, suggesting that ESCs and iPSCs can also be utilized as a cell-free intervention method. Therefore, the method for harvesting mouse embryonic stem cell (mESC)-conditioned medium (mESC-CM) with minimal contamination of serum components (fetal bovine serum, FBS) and feeder cells (mouse embryonic fibroblasts, MEFs) has been highly demanded. Here, the present study demonstrates an optimized method for the collection of mESC-CM under serum- and feeder-free conditions and for the characterization of mESC-CM using senescence-associated multiple readouts. This protocol will provide a method to collect pure mESC-specific secretory factors without serum and feeder contamination.
Introduction
O objetivo deste protocolo é recolher rato com células-tronco embrionárias (MESC) meio climatizados, (MESC-CM) a partir de condições de cultura sérica e livre de alimentação e caracterizar suas funções biológicas.
Em geral, as células-tronco embrionárias (CES) têm um grande potencial para a medicina regenerativa e terapia celular, devido à sua pluripotência e capacidade de auto-renovação 1-3. No entanto, o transplante de células-tronco directa tem várias limitações, tais como a rejeição imunológica e a formação do tumor 4,5. Portanto, uma abordagem livre de células pode fornecer uma estratégia terapêutica alternativa para a medicina regenerativa e envelhecimento intervenções 6,7.
A senescência é visto como um homólogo celular para o envelhecimento dos tecidos e órgãos, caracterizado por um estado permanente de paragem do crescimento, fisiologia celular alterada, e comportamentos. O envelhecimento é o principal fator de risco para doenças prevalentes, incluindo cancro, doenças cardiovasculares, tYpê 2 diabetes e neurodegeneração 8. Uma das características óbvias de envelhecimento é o declínio no potencial regenerativo dos tecidos, que é causada pelo envelhecimento de células-tronco e exaustão 9. Muitos estudos têm demonstrado significativas moléculas farmacológicas, tais como a rapamicina 9, o resveratrol 10, 11 e metformina, e factores sistémicos transmitidas pelo sangue, a saber, GDF11 12, que tem a capacidade de atrasar o envelhecimento de forma consistente e estender a esperança de vida.
No presente estudo, MESC-CM foi colhida sem soro camadas (soro fetal bovino, FBS) e alimentação (rato embrionárias fibroblastos, MEFs) para excluir a contaminação de fatores séricos e factores de secreção de MEFs. Estas condições permitidas para uma CM sérica e livre de alimentador que, consequentemente, permitiu a identificação precisa dos fatores de secreção MESC específicas do.
Este protocolo proposto é altamente eficiente, de custo relativamente eficaz e fácilpara operar. Esta técnica proporciona perspectivas sobre a caracterização de factores solúveis MESC-derivados que podem mediar um efeito anti-senescência, que pode ser utilizada para o desenvolvimento de uma abordagem terapêutica isento de células segura e potencialmente vantajoso para intervenções para as doenças do envelhecimento-associados e de outros regenerativa tratamentos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para a recolha bem sucedida de sérica e MESC-CM sem alimentador, as seguintes sugestões devem ser levados em consideração. O fator mais crítico é usando mESCs passagem precoce para a recolha de MESC-CM. Anteriormente, demonstrou-se que no início passagem MESC-CM tem melhores efeitos anti-envelhecimento em comparação com mESCs passagem final. O número passagem do mESCs tem sido relatada a afectar o seu potencial de desenvolvimento 16 e pluripotência 17.
Embora…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa Ciência Básica Pesquisa (2013R1A1A2060930) e do Programa do Centro de Investigação Médica (2015R1A5A2009124) através da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF), financiado pelo Ministério da Ciência, TIC e planejamento futuro. Esta pesquisa também é apoiado por uma subvenção de funcionamento Start-up do Hospital for Sick Children (HK Sung). Nós gostaríamos de agradecer a Laura Barwell e Sarah JS Kim por sua excelente ajuda na edição deste manuscrito e Dr. Andras Nagy para fornecer a linha G4 MESC.
Materials
| DMEM | Invitrogen | #11960-044 | |
| FBS | Invitrogen | #30044333 | 20%, ES cell quality |
| Penicillin and streptomycin | Invitrogen | #15140 | 50units/ml penicillin and 50mg/ml strepto |
| -mycin. | |||
| L-glutamine | Invitrogen | #25030 | 2mM |
| Nonessential amino acids (NEAA) | Invitrogen | #11140 | 100uM |
| β-mercaptoethanol | Sigma | #M3148 | 100uM |
| Leukemia inhibitory factor | Millipore | #ESG1107 | 100units/ml |
| OPTI-MEM | Invitrogen | #22600 | |
| X-gal | Sigma | #B4252 | 1mg/ml |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148 | 3.70% |
| Dimethylformamide (DMF) | Sigma | #D4551 | |
| Potassium ferricyanide | Aldrich | #455946 | 5mM |
| potassium ferrocyanide | Aldrich | #455989 | 5mM |
| NaCl | Sigma | #S7653 | 150mM |
| MgCl2 | Sigma | #M2393 | 2mM |
| Mytomycin C | Sigma | #M4287 | 10ug/ml |
| Propidium iodide | Sigma | #P4170 | 50ug/ml |
| TRIzol | Ambion | #15596018 | |
| M-MLV reverse transcript-tase | Promega | #M170B | |
| Power SYBR Green PCR master mix | Applied Biosystems | #4367659 | |
| HDFs, NHDF-Ad-Der-Fibroblast | LONZA | #CC-2511 | |
| Bottle top filter, | Corning | #430513 | 0.2μm |
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