In Situ Påvisning og enkelt celle kvantificering af Metal metaloxid bruger nukleare Microprobe analyse
Summary
Vi beskriver en metode til påvisning af kemiske elementer nuværende in situ i menneskeceller samt deres in vitro- kvantificering. Metoden er velegnet til enhver celletype og er især nyttig for kvantitative kemiske analyser i enkelt celler efter in vitro- metal oxide nanopartikler eksponering.
Abstract
Mikro-analytiske teknikker baseret på grundstof imaging aktiverer lokalisering og kvantificering af kemiske sammensætning på cellulært niveau. De tilbyder nye muligheder for karakterisering af levende systemer og er særlig velegnet til at opdage, lokalisere og kvantificering af tilstedeværelsen af metal metaloxid både i biologiske prøver og miljøet. Faktisk opfylde disse teknikker alle krav med hensyn til (i) følsomhed (fra 1 op til 10 µg.g-1 for tørre masse), (ii) mikrometer række rumlige opløsning og (iii) multi-element påvisning. I betragtning af disse karakteristika, microbeam grundstof imaging kan kraftigt supplere rutinemæssig Billeddannende teknikker såsom optiske og Fluorescens mikroskopi. Denne protokol beskriver, hvordan du udføre en nuklear microprobe analyse på kulturperler celler (U2OS) udsættes for titandioxid nanopartikler. Celler skal vokse og udsættes direkte i en specialdesignet prøveholderen anvendes på optisk mikroskop og nukleare microprobe analyse faser. Springet-freeze kryogene fiksering af prøverne bevarer både den cellulære organisation og grundstof distribution. Samtidige nukleare microprobe analyse (scanning transmission ion mikroskopi, Rutherford backscattering massespektrometri og partikel induceret X-ray emission) udføres på prøven indeholder oplysninger om den cellulære tæthed, den lokal distribution af de kemiske elementer, såvel som det cellulære indhold af nanopartikler. Der er et voksende behov for sådanne analytiske værktøjer inden for biologi, navnlig de nye led i projektgruppen for Nanotoksikologi og Nanomedicin som vores forståelse af samspillet mellem nanopartikler og biologiske prøver skal uddybes. Især som nukleare microprobe analyse ikke kræver nanopartikler skal mærkes, er nanopartikel mængder kvantificerbare en enkelt celle ad gangen i en celle population, uafhængigt af deres overflade tilstand.
Introduction
Cellulære homøostase bestemmes af optagelse kontrol, assimilation og intracellulære lokalisering af forskellige sporstoffer (ioner, metaller, eksogene uorganiske forbindelser). Disse komponenter er ofte i form af spor, men ikke desto mindre kan have en betydelig virkning i system fysiologi. Studiet af celle Biokemi i både normale og patologiske/stressede situationer er således en nøgle-skridt i retning af en samlet forståelse af cellulære metaboliske mekanismer. Derfor, udvikling af imaging og analytiske teknikker gør det muligt for undersøgelse af intracellulære kemiske mængder, strukturelle organisation og deres beslægtede metaboliske funktioner bliver nødvendigt. Meget få metoder er i stand til at give en i situ kvantitative stykke af oplysninger om den samlede kemiske natur for en given prøve. Bortset fra metoder analysere prøver i løs form, i situ analyser overveje biologiske prøver i deres fremsendte uden at miste masse og strukturelle oplysninger, dermed bevare deres konstituerende kemikalier (sporstoffer og ioner) og proteiner. Desuden, som nanovidenskab fortsætter med at udvikle, bedre billedbehandling og analysemetoder for miljøovervågning på det cellulære skala vil være nødvendigt at observere og kvantificere nano-objekt adfærd og interaktioner. 1
Nanopartikler (NPs) har været defineret som objekter udstiller mindst én facial dimension i række 1 og 100 nm. 2 på grund af deres særlige fysisk-kemiske egenskaber, NPs er flittigt brugt i industrien. NPs er ansat i bio-anvendelser og Nanomedicin. 3 , 4 trods de mange fysisk-kemiske egenskaber af NPs, kan de skabe nogle risici for negative virkninger på menneskers sundhed og miljøet. Disse risici kan være fremkaldt af både langvarige og gentagne engagementer på forskellige koncentrationsniveauer og dette endnu ikke blevet klart fastlagt. 5 , 6 , 7 , 8 især skæbne af NPs inde i cellerne og de tilknyttede cellulære svar er, til dato, ikke fuldt beskrevet. Dette er delvis på grund af knaphed på metoder, der giver mulighed for påvisning og kvantificering af internaliseret NPs i en enkelt celle. 9
De klassisk analytiske værktøjer, der anvendes til at anslå den cellulære dosis af nanopartikler er microscopies, massespektrometri (MS), koblet induktivt plasma MS (ICP-MS)10,11 og væskekromatografi MS (LC-MS), men de kun giver nyttige oplysninger på makroskopisk skala. Ingen af dem kan give en præcis vurdering af subcellulært NPs indholdet eller NPs distribution uden brug af fraktionering metoder. En systematisk vurdering af dosis-respons er dermed umuligt med disse metoder, i stedet for metoder baseret på atomare spektroskopi såsom nukleare microprobe analyse12,13, synkrotron X-ray Fluorescens mikroskopi14 , og sekundære Ion massespektrometri (SIMS). 15 , 16 disse metoder er særligt interessant, da de komplementerer bemærkninger ved hjælp af Fluorescens mikroskopi, især når NPs ikke kan mærkes med fluorescerende molekyler og således undersøges i deres hjemstat. Til en vis grad, selv når NPs er podet med fluorophores, (i) kvantificering er fortsat vanskelig fordi det tagging niveau pr. NP er ukendt og (ii) den kemiske modifikation af NP overflade kan ændre dets cellulære fordeling.
I denne artikel vil vi fokusere på en metode baseret på en kombination af nukleare microprobe teknikker med henblik på imaging morfologi og elementært sammensætning af biologiske prøver i dur, mol, og spore koncentrationer.
Nukleare microprobe analyse viser sig for at være særligt velegnet til måling af kemisk sporstoffer i biologisk væv. Både beam laterale opløsning (0,3 til 1 µm) og følsomhed i grundstof påvisning (fra 1 til 10 µg.g-1 tør masse) er velegnet til studier på cellulært niveau. Nukleare microprobe teknikker er baseret på partikler påvisning (fotoner, elektroner, ioner) udsendes efter ion lysstråle (typisk kører på MeV energier) interagerer med atomer til stede i prøven. Interaktioner forekommer i celler er hovedsagelig: 1) excitation/ionisering af atomer efterfulgt af en emission af fotoner efter atomer tilbage til deres grundlæggende tilstand; og 2) udbredelse af indgående partikler fører til at ændre i deres energi og retning. Måling af udsendte partikel energi allowsthe identifikation af atomer involveret i samspillet. For at udføre kortlægning af elementer, er ion microbeam gentagne gange scannet over prøveoverfladen, ofte over et areal på omkring 100 af 100 µm2 indeholder flere celler. Udsendte partikler er opdaget og deres energi er registreret for hver bjælke. Sortering af partikler efter stråle position, er således at identificere den ansvarlige for udledningen af sådanne partikler struktur formålet med data behandling. Her, beskriver vi netop en fremgangsmåde baseret på Fluorescens mikroskopi og nukleare microprobe analyse til at opdage samt at kvantificere eksogene NPs på de cellulære og subcellulære skalaer, for at undersøge konsekvenserne af NP interaktioner med levende systemer. Vi skal især fokusere på de muligheder, som denne metode med hensyn til i situ kvantificering af titandioxid nanopartikler (TiO2 NPs) aggregater på subcellulært niveau.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi beskriver en metode at give nyttige oplysninger ud over hvad der er muligt med andre billeddiagnostiske teknikker, navnlig på subcellulært niveau. Ud over sin billeddannelse evne tilbyder nukleare microprobe analyse også mulighederne for kvantificering af kemiske elementer ind i sammensætningen af en biologisk prøve. I det foreliggende arbejde, vi undersøgte menneskelige cellepopulationer og fokuseret ned til analyse af en valgte region af interesse baseret på en enkelt celle udsat for TiO2 NPs. Komb…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Serge Borderes for lede og redigering af video. Agenturets franske National forskning støtter forskningsprogrammet TITANIUMS (ANR CES 2010, n ° CESA 009 01). CNRS og det Europæiske Fællesskab som integration virksomhed leveret “støtte af offentlige og industrielle forskning ved hjælp af Ion stråle teknologi (ånden)” under EF kontrakt n ° 227012. Dette arbejde er blevet støttet af Marie Curie-aktioner – indledende uddannelse netværk (ITN) som en “integrere aktivitet støtte Postgraduate Research med praktikophold i industri og uddannelse Excellence” (SPRITE, D1.3) under EF kontrakt nr. 317169. C’NANO Grand Sud Ouest og regionen Aquitaine støtter forskningsprogrammet TOX-NANO (n ° 20111201003) og forskningsprogrammet POPRA (n ° 14006636-034).
Materials
| Cell culture | |||
| U2OS | ATCC, LGC STANDARDS | ATCC HTB-96 | |
| Medium MCCOY 5A w/o L-Glutamine | Dominique DUTSCHER | L0211-500 | |
| FBS 500 mL | Dominique DUTSCHER | 500105U | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 11548876 | |
| L-Glutamine 200 mM, 100 mL | Invitrogen | 25030024 | |
| Geneticin, 20 mL | ThermoFisher Scientific | 10092772 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% (v/v) 500 mL | ThermoFisher Scientific | 11570626 | |
| Viromer Red | Lipocalyx | VR-01LB-01 | |
| Matrix-roGFP Plasmid | AddGene | #49437 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher Scientific | H3570 | Handle with care |
| NPs preparation | |||
| TiO2 P25 AEROXIDE | Degussa/Evonik | ||
| Tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC) | SIGMA-ALDRICH | T3163 | Surface modification of NPs |
| Sample preparation | |||
| Polycarbonate foil | Goodfellow | CT301020 | |
| Polyether Ether Ketone support (PEEK) | Matechplast | A-239-4047 | |
| Ethanol, ACS absolute | SIGMA-ALDRICH | 02860-6x1L | |
| Chlorform, Anhydrous, 99% | SIGMA-ALDRICH | 372978-1L | Caution toxic |
| Formvar 100 g | Agar Scientific | AGR1201 | Harmful. Use in a concentration of 10 µg per mL of chloroform |
| NaOH | SIGMA-ALDRICH | S5881-500G | |
| Sample fixation | |||
| Powder, 95% Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | 158127-500G | Caution toxic. Use as a 4% solution in PBS |
| PBS (pH 7.4, without Ca2+ and Mg2+) | ThermoFisher Scientific | 11503387 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent | ThermoFisher Scientific | P36934 | |
| Triton X-100 | SIGMA-ALDRICH | 93443 | Harmful |
| Sample cryofixation | |||
| Liquid nitrogen | air liquids sante | Harmful | |
| Methylbutane >=99% | SIGMA-ALDRICH | M32631-1L | Caution toxic |
| Aluminium transfer plate | Home-made | ||
| Distilled and deionized water | Home-made | Produced in the laboratory using the Barnstead Smart2Pure system | |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | |
| Equipment | |||
| Barnstead Smart2Pure | ThermoFisher Scientific | 50129870 | |
| Biosafety bench, class II | ThermoFisher Scientific | MSC-Advantage | |
| TC20 automated cell counter | Biorad | 145-0102SP | |
| Counting slides 2 wells | Biorad | 1450016 | |
| PIPS detector, 25 mm2, 12 keV energy resolution @5.5 MeV | Canberra | PD25-12-100AM | |
| High-resolution Si (Li) solid-state detector,145-eVenergy resolution, @Mn-Kα | Oxford Instruments | ||
| Everhart-Thornley type secondary electron detector (SED) | Orsay Physics | 1-SED | |
| XRF Calibration Standard sodium or Chlorine as NaCl | Micromatter | 34381 | |
| XRF Calibration Standard Magnesium as MgF2 | Micromatter | 34382 | |
| XRF Calibration Standard Aluminium as Al metal | Micromatter | 34383 | |
| XRF Calibration Standard Silicon as SiO | Micromatter | 34384 | |
| XRF Calibration Standard Sulfur as CuSx | Micromatter | 34385 | |
| XRF Calibration Standard Calcium as CaF2 | Micromatter | 34387 | |
| XRF Calibration Standard Titanium as Ti metal | Micromatter | 34388 | |
| XRF Calibration Standard Iron as Fe metal | Micromatter | 34389 | |
| Sonicator 750W | Sonics Materials | 11743619 | |
| 3MM microprobe | Bioblock scientific | 220-05 | |
| Lyophilizer in vacuum | Elexience | EK3147 | |
| Optical microscope Zeiss AxioObserver Z1 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 431006-9901 | |
| Motorized stage xy | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 432031-9902 | |
| EC Plan-Neofluar 20X, NA 0.50 Ph2 M27 objective | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 420351-9910 | |
| Plan-Apochromat 63X, NA 1,40 Ph3M27 objective | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 420781-9910 | |
| Zeiss filterset 02 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 488002-9901 | |
| Zeiss filterset 38HE | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 489038-9901 | |
| Zeiss filterset 31 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 000000-1031-350 | |
| Chemical fume hood | Erlab | Captair SD321 | |
| Particle accelerator | HVEE | singletron | |
| Software | |||
| ImageJ software | National Institutes of health, USA | ImageJ 1.51 | |
| SimNRA software | Max-Planck-Institut für Plasmaphysik, Germany | SIMNRA 6.06 | |
| Gupix software | Guelph university, Canada | GUPIXWIN 2.2.4 |
References
- Krug, H. F., Wick, P. Nanotoxicology: An Interdisciplinary Challenge. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (6), 1260-1278 (2011).
- Van Hove, M. A. From surface science to nanotechnology. Catalysis Today. 113 (3-4), 133-140 (2006).
- Le Trequesser, Q., Seznec, H., Delville, M. H. Functionalized nanomaterials: their use as contrast agents in bioimaging: mono- and multimodal approaches. Nanotox. Rev. 2 (2), 125-169 (2013).
- Oberdorster, G. Safety assessment for nanotechnology and nanomedicine: concepts of nanotoxicology. J. Int. Med. , 89-105 (2009).
- Savolainen, K., et al. Nanotechnologies, engineered nanomaterials and occupational health and safety – A review. Saf. Sci. 48 (8), 957-963 (2010).
- Savolainen, K., Alenius, H., Norppa, H., Pylkkanen, L., Tuomi, T., Kasper, G. Risk assessment of engineered nanomaterials and nanotechnologies – A review. Toxicol. 269 (2-3), 92-104 (2010).
- Arora, S., Rajwade, J. M., Paknikar, K. M. Nanotoxicology and in vitro studies: The need of the hour. Toxicol. . Appl. Pharm. 258 (2), 151-165 (2012).
- Donaldson, K. Resolving the nanoparticles paradox. Future Med. 1 (2), 229-234 (2006).
- Schaumann, G. E., et al. Understanding the fate and biological effects of Ag- and TiO2-nanoparticles in the environment: The quest for advanced analytics and interdisciplinary concepts. Sci Total Environ. 535, 3-19 (2014).
- Olesik, J. W. . Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometers. Treatise on Geochemistry. , (2014).
- Krystek, P. A review on approaches to bio-distribution studies about gold and silver engineered nanoparticles by inductively coupled plasma mass spectrometry. Microchem. J. 105 (November 2011), 39-43 (2012).
- Le Trequesser, Q., et al. Multimodal correlative microscopy for in situ detection and quantification of chemical elements in biological specimens. Applications to nanotoxicology. J .Chem. Biol. 8 (4), 159-167 (2015).
- Le Trequesser, Q., et al. Single cell in situ detection and quantification of metal oxide nanoparticles using multimodal correlative microscopy. Anal. Chem. 86 (15), 7311-7319 (2014).
- Ackermann, C. M., Lee, S., Chang, C. J. Analytical Methods for Imaging Metals in Biology: From Transition Metal Metabolism to Transition Metal Signaling. Anal. Chem. 89 (1), 22-41 (2017).
- Legin, A. A., et al. NanoSIMS combined with fluorescence microscopy as a tool for subcellular imaging of isotopically labeled platinum-based anticancer drugs. Chem. Sci. 5, 3135 (2014).
- Lanni, E. J., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Mass spectrometry imaging and profiling of single cells. J. Proteomics. 75 (16), 5036-5051 (2012).
- Waypa, G. B., et al. Hypoxia triggers subcellular compartmental redox signaling in vascular smooth muscle cells. Circ. Res. 106 (3), 526-535 (2010).
- Dooley, C. T., et al. Imaging Dynamic Redox Changes in Mammalian Cells with Green Fluorescent Protein Indicators. J. Biol. Chem. 279 (21), 22284-22293 (2004).
- Hanson, G. T., et al. Investigating Mitochondrial Redox Potential with Redox-sensitive Green Fluorescent Protein Indicators. J. Biol. Chem. 279 (13), 13044-13053 (2004).
- Chen, X., Mao, S. S. Titanium dioxide nanomaterials: Synthesis, properties, modifications and applications. Chem. Rev. 107 (7), 2891-2959 (2007).
- Simon, M., Barberet, P., Delville, M. H., Moretto, P., Seznec, H. Titanium dioxide nanoparticles induced intracellular calcium homeostasis modi fi cation in primary human keratinocytes. Towards an in vitro explanation of titanium dioxide nanoparticles toxicity. Nanotox. 5 (June), 125-139 (2011).
- Sorieul, S., et al. An ion beam facility for multidisciplinary research. Nucl. Instr. Meth. Phys. Res., B. 332, 68-73 (2014).
- Barberet, P., et al. First results obtained using the CENBG nanobeam line: Performances and applications. Nucl Instr Meth Phys Res B. 269 (20), 2163-2167 (2011).
- Devès, G., et al. An ImageJ plugin for ion beam imaging and data processing at AIFIRA facility. Nucl. Instr. Meth. Phys. Res. B. 348, 62-67 (2015).
- Mayer, M. . SIMNRA User’s Guide, Report IPP 9/113. , (1997).
- Campbell, J. L., Boyd, N. I., Grassi, N., Bonnick, P., Maxwell, J. A. The Guelph PIXE software package IV. Nucl. Instr. Meth. Phys. Res. B. 268 (20), 3356-3363 (2010).
- Yu, K., Chang, S., Park, S. J., Lim, J., Lee, J. Titanium Dioxide Nanoparticles Induce Endoplasmic Reticulum Stress-Mediated Autophagic Cell Death via Mitochondria- Associated Endoplasmic Reticulum Membrane Disruption in Normal Lung Cells. PLoS ONE. , 1-17 (2015).
