На месте Выявление и количественная оценка одноклеточного наночастиц оксидов металлов, с использованием ядерных рентгенофлуоресцентного анализа
Summary
Мы описываем процедуры для обнаружения химических элементов настоящего в situ в клетки человека, а также их количественная оценка в пробирке . Этот метод хорошо подходит для любого типа клеток и особенно полезен для количественного химического анализа в одиночных клетках в vitro воздействия наночастиц оксидов металлов.
Abstract
Микро аналитические методы, основанные на химический элемент визуализации возможность локализации и количественная оценка химического состава на клеточном уровне. Они предлагают новые возможности для характеристики живых систем и особенно подходят для обнаружения, локализации и количественной оценки присутствия наночастиц оксидов металлов в биологических образцов и окружающей среды. Действительно эти методы все соответствующие требованиям с точки зрения (i) (от 1 до 10 мкг/г-1 сухой массы), (ii) микрометра диапазон пространственное разрешение и (iii) многоэлементных обнаружения. Учитывая эти характеристики, Микролучевой химический элемент изображения могут мощно дополнить обычные методы визуализации такие как оптические и микроскопии флуоресцирования. Этот протокол описывает, как выполнить ядерной рентгенофлуоресцентного анализа на культивируемых клеток (U2OS) подвергается наночастиц двуокиси титана. Клетки должны расти и быть предоставлены непосредственно в держатель специально образца используется на оптический микроскоп и ядерной рентгенофлуоресцентного анализа этапов. Плунге замораживание криогенных фиксации образцов сохраняет клеточной организации и распределения химических элементов. Одновременная ядерной рентгенофлуоресцентного анализа (сканирования передачи ионная микроскопия, Резерфорд обратного рассеяния спектрометрии и частицы индуцированной рентгеновское излучение) на образце предоставляет сведения о сотовых плотность, местного распределения химические элементы, а также клеточного содержания наночастиц. Существует растущая потребность в таких аналитических инструментов в биологии, особенно в контексте возникающих нанотоксикология и наномедицины, для которого необходимо углубить наше понимание взаимодействия между наночастицами и биологических образцов. В частности как ядерная рентгенофлуоресцентного анализа не требует наночастиц для наноситься, обилия наночастиц измеримы вплоть до уровня отдельных клеток в популяции клеток, независимо от состояния их поверхности.
Introduction
Клеточного гомеостаза определяется управления поглощения, ассимиляции и внутриклеточной локализации различных микроэлементов (ионы, металлы, экзогенных неорганических соединений). Эти компоненты являются часто в виде следов, но тем не менее может оказать значительное влияние в физиологии системы. Таким образом исследование клеток биохимии в нормальных и патологических/подчеркнул ситуациях является ключ шаг к достижению общего понимания механизмов клеточного метаболизма. Таким образом развитие изображений и аналитических методов, позволяя расследование внутриклеточных Распространённость химических, структурной организации и их соответствующих метаболических функций становится необходимым. Очень немногие методы способны обеспечить в situ количественных кусок информации, касающейся общей химической природы данного образца. Помимо методов анализа образцов в балк-форме, в situ анализа рассмотреть биологических образцов в их целостность без потери массы и структурной информации, тем самым сохраняя их химических компонентов (ионов и микроэлементы) и белки. Кроме того поскольку нанонауки продолжают развиваться, улучшение изображений и аналитических методов для мониторинга окружающей среды на клеточном уровне необходимо будет наблюдать и количественной оценке нано объект поведения и взаимодействия. 1
Наночастицы (NPs) были определены как объекты выставке по крайней мере одного лица измерения в диапазоне 1 и 100 Нм. 2 из-за их конкретных физико-химических свойств, NPs широко используются в промышленности. ЯИЭ используются в био приложений и наномедицины. 3 , 4 несмотря на многочисленные физико-химические характеристики NPs, они могут создавать некоторые риски неблагоприятных последствий для здоровья человека и окружающей среды. Эти риски можно индуцировать путем длительного и повторяющиеся воздействия на различных уровнях концентрации, и это еще не была четко установлена. 5 , 6 , 7 , 8 в частности, судьба NPs внутри клетки и связанные клеточных реакций являются, на сегодняшний день, описал не полностью. Это отчасти из-за нехватки методов, которые позволяют выявлять и количественной оценки внутренней сети в одну ячейку. 9
Классических аналитических инструментов, используемых для оценки клеточного дозы наночастиц, microscopies, масс-спектрометрия (МС), индуктивно сочетании плазмы мс (ИСП-МС)10,11 и жидкостной хроматографии, MS (LC-MS), но они только обеспечивают Полезная информация на макроскопическом уровне. Ни один из них может предоставить точную оценку субцеллюлярные NPs содержание ни NPs распределения без использования методов фракционирования. Систематическая оценка доза ответ таким образом невозможно с помощью этих методов, в отличие от методов, основанных на атомной спектроскопии таких ядерных рентгенофлуоресцентного анализа12,13, Синхротрон рентгеновской микроскопии флуоресцирования14 и масс-спектрометрия вторичных ионов (SIMS). 15 , 16 эти методы особенно интересны, поскольку они дополняют замечания, сделанные с помощью микроскопии флуоресцирования, особенно когда NPs не могут быть помечены с помощью флуоресцентных молекул и таким образом изучены в их родном государстве. В некоторой степени даже когда NPs привитый с флуорофоров, (i) количественная оценка остается сложной потому, что пометки уровне за NP неизвестна и (ii) химическая модификация поверхности NP может изменить его сотовой распределения.
В этой статье мы ориентируемся на метод, основанный на сочетании методов ядерной микрозондирования, направленный на imaging морфологию и химический состав биологических образцов мажор, минор и проследить концентрации.
Ядерные рентгенофлуоресцентного анализа окажется особенно подходит для измерения химических микроэлементов в биологических тканях. Луч латеральное разрешение (0,3 до 1 мкм) и чувствительность обнаружения химического элемента (от 1 до 10 мкг/г-1 сухой массы) хорошо подходят для исследования на клеточном уровне. Методы ядерной рентгенофлуоресцентного основаны на частицы обнаружения (фотоны, электроны, ионы), выбрасываемых после ионного пучка (обычно работает на энергий МэВ) взаимодействует с атомами в образце. Взаимодействия, происходящие в клетках, в основном: 1) возбуждения/ионизации атомов, следуют излучение фотонов после того, как атомы вернуться к их фундаментальных состояние; и 2) распространение поступающих частиц приводит к изменению их энергия и направление. Измерение выбрасываемых частиц энергии allowsthe идентификации атомов, участвующие во взаимодействии. Чтобы выполнить сопоставление элементов, Ион Микролучевой неоднократно сканируется над поверхностью образца, часто на площади около 100 100 мкм2 , содержащий несколько ячеек. Обнаруживаются испускаемых частиц и их энергия записывается для каждого луча. Сортировка частиц согласно позиции луча, таким образом определение структуры, отвечающей за выброс таких частиц является цель обработки данных. Здесь мы точно описать подход, основанный на микроскопии флуоресцирования и ядерной рентгенофлуоресцентного анализа для обнаружения, а также для количественного определения внешних NPs на клеточном и субклеточном уровнях, с целью изучения последствий NP взаимодействий с живой систем. Мы особенно должны сосредоточиться на возможности, предоставляемые этот метод с точки зрения количественной оценки в situ агрегатов наночастиц (TiO2 NPs) двуокиси титана на субклеточном уровне.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы описываем метод предоставления полезной информации за пределы возможно с другими методы визуализации, особенно на субклеточном уровне. В дополнение к способность изображений ядерных рентгенофлуоресцентного анализа также предлагает возможности количественной оценки химических ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим ограниченный Serge за руководство и редактирования видео. Французский национальный исследовательское агентство поддерживает программу исследований TITANIUMS (НРУ КЕС 2010, n ° CESA 009 01). CNRS и Европейское сообщество как интеграция деятельности представила «поддержка из общественных и промышленных исследований с использованием Ион луч технологии (дух)» под EC контракт n ° 227012. Эта работа была поддержана Мари Кюри действия – начальной подготовки сети (ОИС) как «интеграции деятельности поддержку последипломного исследований с стажировки в промышленности и подготовки передового опыта» (СПРАЙТ, D1.3) по контракту № 317169 ЕС. C’NANO Grand Sud Ouest и региона Аквитания поддерживают программы исследований TOX-NANO (n ° 20111201003) и программа исследований POPRA (n ° 14006636-034).
Materials
| Cell culture | |||
| U2OS | ATCC, LGC STANDARDS | ATCC HTB-96 | |
| Medium MCCOY 5A w/o L-Glutamine | Dominique DUTSCHER | L0211-500 | |
| FBS 500 mL | Dominique DUTSCHER | 500105U | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 11548876 | |
| L-Glutamine 200 mM, 100 mL | Invitrogen | 25030024 | |
| Geneticin, 20 mL | ThermoFisher Scientific | 10092772 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% (v/v) 500 mL | ThermoFisher Scientific | 11570626 | |
| Viromer Red | Lipocalyx | VR-01LB-01 | |
| Matrix-roGFP Plasmid | AddGene | #49437 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher Scientific | H3570 | Handle with care |
| NPs preparation | |||
| TiO2 P25 AEROXIDE | Degussa/Evonik | ||
| Tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC) | SIGMA-ALDRICH | T3163 | Surface modification of NPs |
| Sample preparation | |||
| Polycarbonate foil | Goodfellow | CT301020 | |
| Polyether Ether Ketone support (PEEK) | Matechplast | A-239-4047 | |
| Ethanol, ACS absolute | SIGMA-ALDRICH | 02860-6x1L | |
| Chlorform, Anhydrous, 99% | SIGMA-ALDRICH | 372978-1L | Caution toxic |
| Formvar 100 g | Agar Scientific | AGR1201 | Harmful. Use in a concentration of 10 µg per mL of chloroform |
| NaOH | SIGMA-ALDRICH | S5881-500G | |
| Sample fixation | |||
| Powder, 95% Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | 158127-500G | Caution toxic. Use as a 4% solution in PBS |
| PBS (pH 7.4, without Ca2+ and Mg2+) | ThermoFisher Scientific | 11503387 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent | ThermoFisher Scientific | P36934 | |
| Triton X-100 | SIGMA-ALDRICH | 93443 | Harmful |
| Sample cryofixation | |||
| Liquid nitrogen | air liquids sante | Harmful | |
| Methylbutane >=99% | SIGMA-ALDRICH | M32631-1L | Caution toxic |
| Aluminium transfer plate | Home-made | ||
| Distilled and deionized water | Home-made | Produced in the laboratory using the Barnstead Smart2Pure system | |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | |
| Equipment | |||
| Barnstead Smart2Pure | ThermoFisher Scientific | 50129870 | |
| Biosafety bench, class II | ThermoFisher Scientific | MSC-Advantage | |
| TC20 automated cell counter | Biorad | 145-0102SP | |
| Counting slides 2 wells | Biorad | 1450016 | |
| PIPS detector, 25 mm2, 12 keV energy resolution @5.5 MeV | Canberra | PD25-12-100AM | |
| High-resolution Si (Li) solid-state detector,145-eVenergy resolution, @Mn-Kα | Oxford Instruments | ||
| Everhart-Thornley type secondary electron detector (SED) | Orsay Physics | 1-SED | |
| XRF Calibration Standard sodium or Chlorine as NaCl | Micromatter | 34381 | |
| XRF Calibration Standard Magnesium as MgF2 | Micromatter | 34382 | |
| XRF Calibration Standard Aluminium as Al metal | Micromatter | 34383 | |
| XRF Calibration Standard Silicon as SiO | Micromatter | 34384 | |
| XRF Calibration Standard Sulfur as CuSx | Micromatter | 34385 | |
| XRF Calibration Standard Calcium as CaF2 | Micromatter | 34387 | |
| XRF Calibration Standard Titanium as Ti metal | Micromatter | 34388 | |
| XRF Calibration Standard Iron as Fe metal | Micromatter | 34389 | |
| Sonicator 750W | Sonics Materials | 11743619 | |
| 3MM microprobe | Bioblock scientific | 220-05 | |
| Lyophilizer in vacuum | Elexience | EK3147 | |
| Optical microscope Zeiss AxioObserver Z1 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 431006-9901 | |
| Motorized stage xy | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 432031-9902 | |
| EC Plan-Neofluar 20X, NA 0.50 Ph2 M27 objective | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 420351-9910 | |
| Plan-Apochromat 63X, NA 1,40 Ph3M27 objective | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 420781-9910 | |
| Zeiss filterset 02 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 488002-9901 | |
| Zeiss filterset 38HE | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 489038-9901 | |
| Zeiss filterset 31 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 000000-1031-350 | |
| Chemical fume hood | Erlab | Captair SD321 | |
| Particle accelerator | HVEE | singletron | |
| Software | |||
| ImageJ software | National Institutes of health, USA | ImageJ 1.51 | |
| SimNRA software | Max-Planck-Institut für Plasmaphysik, Germany | SIMNRA 6.06 | |
| Gupix software | Guelph university, Canada | GUPIXWIN 2.2.4 |
References
- Krug, H. F., Wick, P. Nanotoxicology: An Interdisciplinary Challenge. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (6), 1260-1278 (2011).
- Van Hove, M. A. From surface science to nanotechnology. Catalysis Today. 113 (3-4), 133-140 (2006).
- Le Trequesser, Q., Seznec, H., Delville, M. H. Functionalized nanomaterials: their use as contrast agents in bioimaging: mono- and multimodal approaches. Nanotox. Rev. 2 (2), 125-169 (2013).
- Oberdorster, G. Safety assessment for nanotechnology and nanomedicine: concepts of nanotoxicology. J. Int. Med. , 89-105 (2009).
- Savolainen, K., et al. Nanotechnologies, engineered nanomaterials and occupational health and safety – A review. Saf. Sci. 48 (8), 957-963 (2010).
- Savolainen, K., Alenius, H., Norppa, H., Pylkkanen, L., Tuomi, T., Kasper, G. Risk assessment of engineered nanomaterials and nanotechnologies – A review. Toxicol. 269 (2-3), 92-104 (2010).
- Arora, S., Rajwade, J. M., Paknikar, K. M. Nanotoxicology and in vitro studies: The need of the hour. Toxicol. . Appl. Pharm. 258 (2), 151-165 (2012).
- Donaldson, K. Resolving the nanoparticles paradox. Future Med. 1 (2), 229-234 (2006).
- Schaumann, G. E., et al. Understanding the fate and biological effects of Ag- and TiO2-nanoparticles in the environment: The quest for advanced analytics and interdisciplinary concepts. Sci Total Environ. 535, 3-19 (2014).
- Olesik, J. W. . Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometers. Treatise on Geochemistry. , (2014).
- Krystek, P. A review on approaches to bio-distribution studies about gold and silver engineered nanoparticles by inductively coupled plasma mass spectrometry. Microchem. J. 105 (November 2011), 39-43 (2012).
- Le Trequesser, Q., et al. Multimodal correlative microscopy for in situ detection and quantification of chemical elements in biological specimens. Applications to nanotoxicology. J .Chem. Biol. 8 (4), 159-167 (2015).
- Le Trequesser, Q., et al. Single cell in situ detection and quantification of metal oxide nanoparticles using multimodal correlative microscopy. Anal. Chem. 86 (15), 7311-7319 (2014).
- Ackermann, C. M., Lee, S., Chang, C. J. Analytical Methods for Imaging Metals in Biology: From Transition Metal Metabolism to Transition Metal Signaling. Anal. Chem. 89 (1), 22-41 (2017).
- Legin, A. A., et al. NanoSIMS combined with fluorescence microscopy as a tool for subcellular imaging of isotopically labeled platinum-based anticancer drugs. Chem. Sci. 5, 3135 (2014).
- Lanni, E. J., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Mass spectrometry imaging and profiling of single cells. J. Proteomics. 75 (16), 5036-5051 (2012).
- Waypa, G. B., et al. Hypoxia triggers subcellular compartmental redox signaling in vascular smooth muscle cells. Circ. Res. 106 (3), 526-535 (2010).
- Dooley, C. T., et al. Imaging Dynamic Redox Changes in Mammalian Cells with Green Fluorescent Protein Indicators. J. Biol. Chem. 279 (21), 22284-22293 (2004).
- Hanson, G. T., et al. Investigating Mitochondrial Redox Potential with Redox-sensitive Green Fluorescent Protein Indicators. J. Biol. Chem. 279 (13), 13044-13053 (2004).
- Chen, X., Mao, S. S. Titanium dioxide nanomaterials: Synthesis, properties, modifications and applications. Chem. Rev. 107 (7), 2891-2959 (2007).
- Simon, M., Barberet, P., Delville, M. H., Moretto, P., Seznec, H. Titanium dioxide nanoparticles induced intracellular calcium homeostasis modi fi cation in primary human keratinocytes. Towards an in vitro explanation of titanium dioxide nanoparticles toxicity. Nanotox. 5 (June), 125-139 (2011).
- Sorieul, S., et al. An ion beam facility for multidisciplinary research. Nucl. Instr. Meth. Phys. Res., B. 332, 68-73 (2014).
- Barberet, P., et al. First results obtained using the CENBG nanobeam line: Performances and applications. Nucl Instr Meth Phys Res B. 269 (20), 2163-2167 (2011).
- Devès, G., et al. An ImageJ plugin for ion beam imaging and data processing at AIFIRA facility. Nucl. Instr. Meth. Phys. Res. B. 348, 62-67 (2015).
- Mayer, M. . SIMNRA User’s Guide, Report IPP 9/113. , (1997).
- Campbell, J. L., Boyd, N. I., Grassi, N., Bonnick, P., Maxwell, J. A. The Guelph PIXE software package IV. Nucl. Instr. Meth. Phys. Res. B. 268 (20), 3356-3363 (2010).
- Yu, K., Chang, S., Park, S. J., Lim, J., Lee, J. Titanium Dioxide Nanoparticles Induce Endoplasmic Reticulum Stress-Mediated Autophagic Cell Death via Mitochondria- Associated Endoplasmic Reticulum Membrane Disruption in Normal Lung Cells. PLoS ONE. , 1-17 (2015).
