In Situ Rilevazione e quantificazione di singola cellula delle nanoparticelle di ossido di metallo mediante analisi della microsonda del nucleare
Summary
Descriviamo una procedura per l’individuazione di elementi chimici presenti in situ in cellule umane, nonché la loro quantificazione in vitro . Il metodo è adatto a qualsiasi tipo di cellula ed è particolarmente utile per l’analisi chimiche quantitative in singole cellule in vitro esposizione di nanoparticelle di ossido di metallo.
Abstract
Tecniche di micro-analitico basati su formazione immagine elemento chimico consentono la localizzazione e la quantificazione della composizione chimica a livello cellulare. Essi offrono nuove possibilità per la caratterizzazione dei sistemi viventi e sono particolarmente appropriati per rilevare, localizzare e quantificare la presenza di nanoparticelle di ossido di metallo sia in campioni biologici e per l’ambiente. Infatti, queste tecniche tutti i pertinenti requisiti in termini di (i) sensibilità (da 1 fino a 10 µg.g-1 di massa secca), (ii) micrometro gamma risoluzione spaziale e (iii) multi-elemento rilevamento. Date queste caratteristiche, formazione immagine di elemento chimico microbeam possa potentemente integrare tecniche di imaging routine come ottica e microscopia a fluorescenza. Questo protocollo viene descritto come eseguire un’analisi della microsonda nucleare su cellule in coltura (U2OS) esposte alle nanoparticelle di biossido di titanio. Le cellule devono crescere ed essere esposte direttamente in un portacampioni appositamente utilizzato il microscopio ottico e nelle fasi di analisi della microsonda nucleare. Tuffo-congelamento criogenica fissazione dei campioni conserva sia l’organizzazione e la distribuzione di elemento chimico. Analisi simultanea della microsonda nucleare (microscopia dello ione trasmissione, Rutherford backscattering spettrometria e particella indotto da emissione di raggi x) eseguita sul campione fornisce informazioni circa la densità cellulare, la distribuzione locale di gli elementi chimici, come pure il contenuto cellulare di nanoparticelle. C’è un crescente bisogno di tali strumenti analitici all’interno di biologia, soprattutto in ambito emergente di nanotossicologia e nanomedicina per cui occorre approfondire la nostra comprensione delle interazioni tra nanoparticelle e campioni biologici. In particolare, come analisi della microsonda nucleare non richiedono le nanoparticelle siano etichettati, abbondanze di nanoparticelle sono quantificabili fino al livello di singola cellula in una popolazione di cellule, indipendentemente dal loro stato superficiale.
Introduction
L’omeostasi cellulare è determinato dal controllo di assorbimento, assimilazione e localizzazione intracellulare di diversi oligoelementi (ioni, metalli, composti inorganici esogeni). Questi componenti sono frequentemente sotto forma di tracce, ma tuttavia possono avere un impatto considerevole nella fisiologia del sistema. Così, lo studio della biochimica cellulare in situazioni sia normali che patologiche/sottolineato è un chiave-passo verso una comprensione globale dei meccanismi metabolici cellulari. Di conseguenza, lo sviluppo di tecniche di imaging e analitiche che consente l’indagine delle abbondanze chimiche intracellulari, organizzazione strutturale e delle funzioni metaboliche correlate diventa necessario. Metodi molto pochi sono in grado di fornire un pezzo di in situ quantitativa di informazioni riguardanti la natura chimica complessiva di un dato campione. Oltre a metodi di analisi dei campioni in forma bulk, analisi in situ considerano campioni biologici nella loro integralità senza perdere le informazioni strutturali e massa, preservando così le loro sostanze chimiche (oligoelementi e ioni) e proteine. Inoltre, come le nanoscienze continuano a sviluppare, formazione immagine migliorata e metodi analitici per il monitoraggio ambientale su scala cellulare sarà necessari osservare e quantificare le interazioni e comportamenti di nano-oggetto. 1
Le nanoparticelle (NP) sono state definite come oggetti che esibiscono almeno una dimensione facciale nell’intervallo da 1 e 100 nm. 2 a causa di loro particolari proprietà fisico-chimiche, NPs sono ampiamente utilizzati nell’industria. Dei criteri di rete sono impiegati in bio-applicazioni e nella nanomedicina. 3 , 4 nonostante le numerose caratteristiche fisico-chimiche di NPs, potrebbero generare alcuni rischi di effetti negativi sulla salute umana e l’ambiente. Questi rischi possono essere indotti da esposizioni sia prolungate e ripetitive a vari livelli di concentrazione e questo non è ancora stata chiaramente stabilito. 5 , 6 , 7 , 8 In particolare, il destino di NPs all’interno di cellule e le risposte cellulari associate sono, ad oggi, non completamente descritto. Ciò è in parte dovuto la scarsità di metodi che consentono la rilevazione e quantificazione di NPs interiorizzata in una singola cella. 9
Gli strumenti analitici classici usati per stimare la dose cellulare delle nanoparticelle sono microscopie, spettrometria di massa (MS), accoppiato induttivamente al plasma (ICP-MS) MS10,11 e cromatografia liquida (LC-MS) MS, ma forniscono solo informazioni utili su scala macroscopica. Nessuno di loro può fornire una valutazione precisa del contenuto NPs subcellulare né la distribuzione dei criteri di rete senza l’uso di metodi di frazionamento. Una valutazione sistematica della dose-risposta è dunque impossibile con questi metodi, in contrasto con metodi basati sulla spettroscopia atomica come microsonda nucleare analisi12,13, microscopia di fluorescenza di raggi x di sincrotrone14 e spettrometria di massa di ioni secondari (SIMS). 15 , 16 questi metodi sono particolarmente interessanti come si completano le osservazioni fatte utilizzando la microscopia a fluorescenza, soprattutto quando NPs non possono essere etichettati con molecole fluorescenti e sono quindi studiati nel loro stato nativo. In una certa misura, anche quando NPs si innestano con fluorofori, (i) quantificazione rimane difficile perché il livello di codifica per NP è sconosciuto e (ii) la modificazione chimica della superficie NP può modificare la sua distribuzione cellulare.
In questo articolo, ci concentriamo su un metodo basato su una combinazione di tecniche nucleari della microsonda puntando la morfologia e la composizione elementare di campioni biologici in maggiore, minore, di imaging e le concentrazioni di traccia.
Analisi della microsonda nucleare dimostra di essere particolarmente adatto per la misura di elementi chimici in traccia nei tessuti biologici. La risoluzione laterale fascio (0.3-1 µm) e la sensibilità nella rilevazione di elemento chimico (da 1 a 10 µg.g-1 massa secca) sono adatti per studi a livello cellulare. Nucleare della microsonda tecniche si basano sulla rilevazione di particelle (fotoni, elettroni, ioni) generato dopo che il fascio di ioni (in genere in esecuzione alle energie di MeV) interagisce con gli atomi presenti nel campione. Interazioni che si verificano nelle cellule sono principalmente: 1) eccitazione/ionizzazione degli atomi seguita da un’emissione di fotoni dopo atomi tornano allo stato fondamentale; e 2) diffusione delle particelle in arrivo che porta a cambiare nella loro energia e direzione. La misurazione di identificazione permette di particella emessa energia degli atomi coinvolti nell’interazione. Per eseguire il mapping di elementi, la microbeam ione viene analizzato ripetutamente sopra la superficie del campione, spesso su una superficie di circa 100 da 100 µm2 contengono parecchie cellule. Particelle emesse vengono rilevate e la loro energia è registrato per ogni posizione di fascio. L’ordinamento delle particelle in base alla posizione di fascio, identificando così la struttura responsabile per l’emissione di tali particelle è lo scopo del trattamento dei dati. Qui, descriviamo precisamente un approccio basato sulla microscopia a fluorescenza e analisi nucleari della microsonda per rilevare così come quantificare esogeno NPs alla scala cellulare e subcellulare, al fine di indagare le conseguenze delle interazioni di NP con soggiorno sistemi. Ci concentreremo in particolare sulle opportunità offerte da questo metodo in termini di quantificazione in situ di biossido di titanio (TiO2 NPs) nanoparticelle aggregati a livello subcellulare.
Protocol
Representative Results
Discussion
Descriviamo un metodo che fornisce informazioni utili di là di ciò che è possibile con altre tecniche di imaging, soprattutto a livello subcellulare. Oltre alla sua capacità di imaging, analisi della microsonda nucleare offre anche possibilità di quantificazione degli elementi chimici che entrano nella composizione di un campione biologico. Nel lavoro attuale, abbiamo studiato le popolazioni delle cellule umane e concentrata verso il basso per l’analisi di una regione selezionata di interesse basato su una singola c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Serge Borderes per regia e montaggio del video. La French National Research Agency supporta il programma di ricerca Titani (ANR CES 2010, n ° CESA 01 009). Il CNRS e la Comunità europea come un’attività di integrazione fornito il “supporto di pubblico e industriale ricerca utilizzando Ion fascio tecnologia (spirito)” sotto il CE contratto n ° 227012. Quest’opera è stata sostenuta da azioni Marie Curie – reti di formazione iniziale (ITN) come un “integrando attività di supporto post-laurea ricerca con stages in industria e formazione d’eccellenza” (SPRITE, D1.3) sotto contratto CE n. 317169. C’NANO Grand Sud Ouest e la regione Aquitania supportano il programma di ricerca TOX-NANO (n ° 20111201003) e il programma di ricerca POPRA (n ° 14006636-034).
Materials
| Cell culture | |||
| U2OS | ATCC, LGC STANDARDS | ATCC HTB-96 | |
| Medium MCCOY 5A w/o L-Glutamine | Dominique DUTSCHER | L0211-500 | |
| FBS 500 mL | Dominique DUTSCHER | 500105U | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 11548876 | |
| L-Glutamine 200 mM, 100 mL | Invitrogen | 25030024 | |
| Geneticin, 20 mL | ThermoFisher Scientific | 10092772 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% (v/v) 500 mL | ThermoFisher Scientific | 11570626 | |
| Viromer Red | Lipocalyx | VR-01LB-01 | |
| Matrix-roGFP Plasmid | AddGene | #49437 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher Scientific | H3570 | Handle with care |
| NPs preparation | |||
| TiO2 P25 AEROXIDE | Degussa/Evonik | ||
| Tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC) | SIGMA-ALDRICH | T3163 | Surface modification of NPs |
| Sample preparation | |||
| Polycarbonate foil | Goodfellow | CT301020 | |
| Polyether Ether Ketone support (PEEK) | Matechplast | A-239-4047 | |
| Ethanol, ACS absolute | SIGMA-ALDRICH | 02860-6x1L | |
| Chlorform, Anhydrous, 99% | SIGMA-ALDRICH | 372978-1L | Caution toxic |
| Formvar 100 g | Agar Scientific | AGR1201 | Harmful. Use in a concentration of 10 µg per mL of chloroform |
| NaOH | SIGMA-ALDRICH | S5881-500G | |
| Sample fixation | |||
| Powder, 95% Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | 158127-500G | Caution toxic. Use as a 4% solution in PBS |
| PBS (pH 7.4, without Ca2+ and Mg2+) | ThermoFisher Scientific | 11503387 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent | ThermoFisher Scientific | P36934 | |
| Triton X-100 | SIGMA-ALDRICH | 93443 | Harmful |
| Sample cryofixation | |||
| Liquid nitrogen | air liquids sante | Harmful | |
| Methylbutane >=99% | SIGMA-ALDRICH | M32631-1L | Caution toxic |
| Aluminium transfer plate | Home-made | ||
| Distilled and deionized water | Home-made | Produced in the laboratory using the Barnstead Smart2Pure system | |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | |
| Equipment | |||
| Barnstead Smart2Pure | ThermoFisher Scientific | 50129870 | |
| Biosafety bench, class II | ThermoFisher Scientific | MSC-Advantage | |
| TC20 automated cell counter | Biorad | 145-0102SP | |
| Counting slides 2 wells | Biorad | 1450016 | |
| PIPS detector, 25 mm2, 12 keV energy resolution @5.5 MeV | Canberra | PD25-12-100AM | |
| High-resolution Si (Li) solid-state detector,145-eVenergy resolution, @Mn-Kα | Oxford Instruments | ||
| Everhart-Thornley type secondary electron detector (SED) | Orsay Physics | 1-SED | |
| XRF Calibration Standard sodium or Chlorine as NaCl | Micromatter | 34381 | |
| XRF Calibration Standard Magnesium as MgF2 | Micromatter | 34382 | |
| XRF Calibration Standard Aluminium as Al metal | Micromatter | 34383 | |
| XRF Calibration Standard Silicon as SiO | Micromatter | 34384 | |
| XRF Calibration Standard Sulfur as CuSx | Micromatter | 34385 | |
| XRF Calibration Standard Calcium as CaF2 | Micromatter | 34387 | |
| XRF Calibration Standard Titanium as Ti metal | Micromatter | 34388 | |
| XRF Calibration Standard Iron as Fe metal | Micromatter | 34389 | |
| Sonicator 750W | Sonics Materials | 11743619 | |
| 3MM microprobe | Bioblock scientific | 220-05 | |
| Lyophilizer in vacuum | Elexience | EK3147 | |
| Optical microscope Zeiss AxioObserver Z1 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 431006-9901 | |
| Motorized stage xy | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 432031-9902 | |
| EC Plan-Neofluar 20X, NA 0.50 Ph2 M27 objective | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 420351-9910 | |
| Plan-Apochromat 63X, NA 1,40 Ph3M27 objective | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 420781-9910 | |
| Zeiss filterset 02 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 488002-9901 | |
| Zeiss filterset 38HE | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 489038-9901 | |
| Zeiss filterset 31 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 000000-1031-350 | |
| Chemical fume hood | Erlab | Captair SD321 | |
| Particle accelerator | HVEE | singletron | |
| Software | |||
| ImageJ software | National Institutes of health, USA | ImageJ 1.51 | |
| SimNRA software | Max-Planck-Institut für Plasmaphysik, Germany | SIMNRA 6.06 | |
| Gupix software | Guelph university, Canada | GUPIXWIN 2.2.4 |
References
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