제자리에서 검색 및 핵 현미경 분석을 사용 하 여 금속 산화물 나노 입자의 단일 셀 정량화
Summary
우리 화학 요소 존재 원래의 인간 세포에 그들의 생체 외에서 정량화의 검출을 위한 절차를 설명합니다. 메서드는 모든 셀 종류에 적합 하 고는 금속 산화물 나노 입자 노출 체 외에서 다음 단일 셀에 정량적 화학 분석에 특히 유용.
Abstract
화학 원소 영상 기반 마이크로 분석 기법 지역화 및 세포 수준에서 화학 성분의 정량화를 활성화 합니다. 그들은 생활 시스템의 특성에 대 한 새로운 가능성을 제공 하 고 특히 탐지, 지역화 및 생물 표본 및 환경 모두에서 금속 산화물 나노 입자의 존재를 측정에 적합. 사실, 이러한 기술을 모든 (i) (1에서 최대 건조 질량의 10 µg.g-1 ), (ii) 마이크로미터 범위 공간 해상도, 및 (iii) 여러 요소 검색 관련 요구 사항을 충족. 이러한 특성을 감안할 때, microbeam 화학 원소 영상 수 있습니다 강력 하 게 보완 일상적인 이미징 기술을 같은 광학 및 형광 현미경 검사 법. 이 프로토콜에는 경작된 한 세포 (U2OS) 이산화 티타늄 나노 입자에 노출에 핵 현미경 분석을 수행 하는 방법을 설명 합니다. 셀 성장 해야 한다 고 핵 현미경 분석 단계와 광학 현미경에 사용 되는 특별히 설계 된 샘플 홀더에서 직접 노출. 샘플의 식이 동결 극저온 고정 세포 조직과 화학 원소 분포를 유지합니다. 샘플에 동시 핵 현미경 분석 (스캐닝 전송 이온 현미경, 러더퍼드 backscattering 분석 및 입자 유도 된 x 선 방출) 세포 밀도의 지역 분포에 대 한 정보를 제공 합니다. 화학 요소 뿐만 아니라 나노 입자의 휴대 전화 콘텐츠. 생물학, 특히 Nanotoxicology 및 나노 입자와 생물 학적 샘플 사이의 상호 작용의 우리의 이해를 심화 해야 합니다는 Nanomedicine 신흥 컨텍스트 내에서 이러한 분석 도구에 대 한 필요성이 있다. 특히, 핵 현미경 분석 이라는 것을 나노 입자를 필요로 하지 않습니다, 나노 나타났는데 그들의 표면 상태에 상관 없이 세포 인구에서 개별 셀 수준까지 가늠할 수 있습니다.
Introduction
세포질 항상성 이해 컨트롤, 동화 작용, 및 다른 성분 (이온, 금속, 세 무기 화합물)의 세포내 지역화에 의해 결정 됩니다. 이러한 구성 요소 추적의 형태로 자주 하지만 그럼에도 불구 하 고 시스템 생리학에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서, 정상 및 병리학/스트레스 상황에서 세포 생화학의 연구 세포 대사 메커니즘에 대 한 전반적인 이해 향한 키 단계입니다. 따라서, 세포내 화학 나타났는데, 구조적 조직 및 그들의 관련된 대사 기능 조사를 사용 하는 이미징 및 분석 기술의 개발이 필요한 됩니다. 아주 몇 가지 방법이 제자리에 정량의 한 조각이 주어진된 샘플의 전반적인 화학 본질에 관한 정보를 제공할 수 있습니다. 벌크 형태로 샘플을 분석 하는 방법 외에도 현장에서 분석 고려 생물 학적 샘플 자신의 완전에 질량과 구조 정보, 그로 인하여 그들의 구성 화학 물질 (미 량 원소와 이온) 보존을 잃지 않고, 단백질입니다. 또한, 지속적으로 개발 하는 nanosciences, 향상 된 이미징 및 세포 규모 환경 모니터링에 대 한 분석 방법 됩니다 관찰 하 고 계량 나노 개체 동작 및 상호 작용 하는 데 필요한. 1
나노 (NPs) 전시 범위 1와 100 nm에 최소한 하나의 얼굴 차원으로 정의 되었습니다. 2 그들의 특정 물리 화학적 특성 때문에 NPs는 광범위 하 게 업계에서 사용. NPs는 nanomedicine 및 바이오 응용 프로그램에서 채택 된다. 3 , 4 NPs의 수많은 물리 화학적 특성에도 불구 하 고 인간의 건강 및 환경에 불리 한 영향의 몇 가지 위험을 생성할 수 있습니다 그들은. 이러한 위험 다양 한 농도 수준에서 장기간 및 반복 노출에 의해 유도 될 수 있다 그리고 이것은 아직 명확 하 게 설립 되지. 5 , 6 , 7 , 8 특히, 셀과 연결 된 세포질 응답 내부 NPs의 운명은, 날짜, 완전히 설명. 이것은 탐지를 허용 하는 방법의 부족 및 정량화는 단일 셀에 내 면된 NPs의 일부입니다. 9
나노 입자의 셀룰러 복용량 microscopies, 질량 분석 (MS), 추정 하는 데 사용 하는 고전 분석 도구 유도 결합 플라즈마 (ICP-MS) MS10,11 및 액체 크로마토그래피 석사 (LC-석사), 하지만 그들은 단지 제공 거시적인 규모에서 유용한 정보입니다. 그들 중 누구도 subcellular NPs 콘텐츠 분류 방법의 사용 없이 NPs 배급의 정확한 평가 제공할 수 있습니다. 복용량 응답의 체계적인 평가 불가능 따라서 이러한 방법으로, 반대로 핵 현미경 분석12,13, 싱크 로트 론 x-선 형광 현미경14 같은 원자 분광학에 기반으로 하는 방법 , 그리고 2 차 이온 질량 분석 (SIMS). 15 , 16 그들은 형광 현미경을 사용 하 여 만든 관측을 보완, NPs 형광 분자와 함께 표시 될 수 없습니다 및 따라서 그들의 네이티브 국가에서 공부 하는 경우에 특히 이러한 방법은 특히 흥미 있다. 어느 정도까지, NPs는 fluorophores, 함께 융합 하는 경우에 (i) 정량화 남아 어려운 NP 당 태그 수준 알려져 있기 때문에 (ii) NP 표면 화학 수정 세포의 분포를 수정할 수 있습니다.
이 문서에서는, 우리가 이미징 형태학 및 주, 부, 생물학 견본의 원소 구성에 핵 현미경 기술의 조합에 따라 방법에 집중 하 고 농도 추적.
원자력 현미경 분석 특히 생물학 조직에 화학 성분의 측정에 적합을 증명 한다. 빔 측면 해상도 (0.3 ~ 1 μ m) 및 화학 원소 검출에서 감도 (1 ~ 10 µg.g-1 건조 질량)는 세포 수준에서 연구 하는 데 적합 하다. 원자력 현미경 기법 샘플에 존재 원자와 상호 작용 하는 (일반적으로 MeV 에너지에서 실행 되는) 이온 빔 후 방출 입자 검출 (광자, 전자, 이온)를 기반으로 합니다. 셀에 발생 하는 상호 작용은 주로: 1) 여기/이온화 원자 원자를 기본 상태로; 반환 후 광자의 방출 다음의 그리고 2) 그들의 에너지와 방향을 선도 하는 들어오는 입자의 확산. 상호 작용에 관련 된 원자의 방출된 입자 에너지 allowsthe 식별 측정. 요소의 매핑을 수행 하 이온 microbeam는 반복 검색 샘플 표면에 종종 100 µ m2 여러 셀을 포함 하 여 약 100의 지역. 내보낸된 입자 감지 하 고 그들의 에너지는 각 광속 위치에 대 한 기록. 빔 위치에 따라 입자의 정렬, 데이터 처리의 목표는 이러한 입자의 방출에 대 한 책임 구조를 따라서 식별. 여기, 우리는 정확 하 게 형광 현미경 검사 법 및 핵 현미경 분석 검색으로 생활 NP 상호 작용의 결과 조사 하기 위하여 세포질과 세포 하위 스케일에서 exogenous NPs를 계량에 따라 접근을 설명 시스템입니다. 우리는 특히 제자리에 정량화 subcellular 수준에서 이산화 티타늄 나노 (티 오2 NPs)의 관점에서이 방법으로 제공 하는 기회에 집중 한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 subcellular 수준에서 특히 다른 이미징 기술로 가능한 유용한 정보를 제공 하는 방법을 설명 합니다. 이미징 능력, 더불어 핵 현미경 분석 또한 생물 학적 샘플의 구성에서 입력 하는 화학 성분의 정량화의 가능성을 제공 합니다. 현재 작업에서 우리 인간의 세포 인구를 공부 하 고 티 오2 NPs에 노출 하는 단일 셀에 따라 관심의 선택한 영역의 분석으로 집중. 다른 기술을 조합 원소 화?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리 감사 Serge Borderes 감독 및 비디오의 편집. 프랑스 국립 연구 기관 연구 프로그램 TITANIUMS (ANR CES 2010, n ° CESA 009 01)을 지원합니다. CNRS와 통합 활동으로 유럽 공동체 “지원의 공공 및 산업 연구를 사용 하 여 이온 빔 기술 (정신)” EC 계약 n ° 227012에서 제공. 이 작품 EC 계약 번호 317169 마리 퀴리 작업-초기 교육 네트워크 (ITN) “통합 활동 지원 대학원 연구와 인턴쉽에 산업 및 교육 우수” (스프라이트, D1.3)로 지원 되어 있다. C’NANO 그랜드 Sud Ouest 및 지역 아키텐 연구 프로그램 TOX-나노 (n ° 20111201003)와 POPRA (n ° 14006636-034) 연구 프로그램을 지원합니다.
Materials
| Cell culture | |||
| U2OS | ATCC, LGC STANDARDS | ATCC HTB-96 | |
| Medium MCCOY 5A w/o L-Glutamine | Dominique DUTSCHER | L0211-500 | |
| FBS 500 mL | Dominique DUTSCHER | 500105U | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 11548876 | |
| L-Glutamine 200 mM, 100 mL | Invitrogen | 25030024 | |
| Geneticin, 20 mL | ThermoFisher Scientific | 10092772 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% (v/v) 500 mL | ThermoFisher Scientific | 11570626 | |
| Viromer Red | Lipocalyx | VR-01LB-01 | |
| Matrix-roGFP Plasmid | AddGene | #49437 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher Scientific | H3570 | Handle with care |
| NPs preparation | |||
| TiO2 P25 AEROXIDE | Degussa/Evonik | ||
| Tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC) | SIGMA-ALDRICH | T3163 | Surface modification of NPs |
| Sample preparation | |||
| Polycarbonate foil | Goodfellow | CT301020 | |
| Polyether Ether Ketone support (PEEK) | Matechplast | A-239-4047 | |
| Ethanol, ACS absolute | SIGMA-ALDRICH | 02860-6x1L | |
| Chlorform, Anhydrous, 99% | SIGMA-ALDRICH | 372978-1L | Caution toxic |
| Formvar 100 g | Agar Scientific | AGR1201 | Harmful. Use in a concentration of 10 µg per mL of chloroform |
| NaOH | SIGMA-ALDRICH | S5881-500G | |
| Sample fixation | |||
| Powder, 95% Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | 158127-500G | Caution toxic. Use as a 4% solution in PBS |
| PBS (pH 7.4, without Ca2+ and Mg2+) | ThermoFisher Scientific | 11503387 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent | ThermoFisher Scientific | P36934 | |
| Triton X-100 | SIGMA-ALDRICH | 93443 | Harmful |
| Sample cryofixation | |||
| Liquid nitrogen | air liquids sante | Harmful | |
| Methylbutane >=99% | SIGMA-ALDRICH | M32631-1L | Caution toxic |
| Aluminium transfer plate | Home-made | ||
| Distilled and deionized water | Home-made | Produced in the laboratory using the Barnstead Smart2Pure system | |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | |
| Equipment | |||
| Barnstead Smart2Pure | ThermoFisher Scientific | 50129870 | |
| Biosafety bench, class II | ThermoFisher Scientific | MSC-Advantage | |
| TC20 automated cell counter | Biorad | 145-0102SP | |
| Counting slides 2 wells | Biorad | 1450016 | |
| PIPS detector, 25 mm2, 12 keV energy resolution @5.5 MeV | Canberra | PD25-12-100AM | |
| High-resolution Si (Li) solid-state detector,145-eVenergy resolution, @Mn-Kα | Oxford Instruments | ||
| Everhart-Thornley type secondary electron detector (SED) | Orsay Physics | 1-SED | |
| XRF Calibration Standard sodium or Chlorine as NaCl | Micromatter | 34381 | |
| XRF Calibration Standard Magnesium as MgF2 | Micromatter | 34382 | |
| XRF Calibration Standard Aluminium as Al metal | Micromatter | 34383 | |
| XRF Calibration Standard Silicon as SiO | Micromatter | 34384 | |
| XRF Calibration Standard Sulfur as CuSx | Micromatter | 34385 | |
| XRF Calibration Standard Calcium as CaF2 | Micromatter | 34387 | |
| XRF Calibration Standard Titanium as Ti metal | Micromatter | 34388 | |
| XRF Calibration Standard Iron as Fe metal | Micromatter | 34389 | |
| Sonicator 750W | Sonics Materials | 11743619 | |
| 3MM microprobe | Bioblock scientific | 220-05 | |
| Lyophilizer in vacuum | Elexience | EK3147 | |
| Optical microscope Zeiss AxioObserver Z1 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 431006-9901 | |
| Motorized stage xy | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 432031-9902 | |
| EC Plan-Neofluar 20X, NA 0.50 Ph2 M27 objective | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 420351-9910 | |
| Plan-Apochromat 63X, NA 1,40 Ph3M27 objective | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 420781-9910 | |
| Zeiss filterset 02 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 488002-9901 | |
| Zeiss filterset 38HE | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 489038-9901 | |
| Zeiss filterset 31 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 000000-1031-350 | |
| Chemical fume hood | Erlab | Captair SD321 | |
| Particle accelerator | HVEE | singletron | |
| Software | |||
| ImageJ software | National Institutes of health, USA | ImageJ 1.51 | |
| SimNRA software | Max-Planck-Institut für Plasmaphysik, Germany | SIMNRA 6.06 | |
| Gupix software | Guelph university, Canada | GUPIXWIN 2.2.4 |
References
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