In Situ Detectie en eencellige kwantificering van metaaloxide nanodeeltjes met behulp van nucleaire Microprobe analyse
Summary
Beschrijven we een procedure voor de opsporing van chemische elementen aanwezig in situ in menselijke cellen, alsmede hun kwantificering in vitro . De methode is geschikt voor elk celtype en is vooral nuttig voor de kwantitatieve chemische analyses in afzonderlijke cellen na in vitro metaaloxide nanodeeltjes blootstelling.
Abstract
Micro-analytische technieken gebaseerd op scheikundig element imaging inschakelen de lokalisatie en de kwantificering van chemische samenstelling op cellulair niveau. Ze bieden nieuwe mogelijkheden voor de karakterisatie van levende systemen en zijn met name geschikt voor het detecteren, lokaliseren en kwantificeren van de aanwezigheid van metaaloxide nanodeeltjes zowel in biologische monsters en het milieu. Inderdaad, deze technieken die alle voldoen aan desbetreffende eisen wat betreft (i) gevoeligheid (van 1 tot 10 µg.g-1 van droge massa), (ii) micrometer bereik ruimtelijke resolutie, en (iii) multi element detectie. Gegeven deze kenmerken, microbeam scheikundig element imaging kan krachtig aanvullen routine beeldvormingstechnieken zoals optische en fluorescentie microscopie. Dit protocol wordt beschreven hoe een nucleaire microprobe-analyses uit te voeren op gekweekte cellen (U2OS) blootgesteld aan titaandioxide nanodeeltjes. Cellen moeten groeien op en direct in een speciaal ontworpen monsterhouder gebruikt op de optische Microscoop en de nucleaire microprobe analyse fasen worden blootgesteld. Duik-freeze cryogene fixatie van de monsters behoudt de cellulaire organisatie zowel de chemische elementdistributie. Gelijktijdige nucleaire microprobe analyse (scanning transmissie ion microscopie, Rutherford backscattering spectrometrie en deeltje geïnduceerde X-ray emissie) uitgevoerd op het monster bevat informatie over de cellulaire dichtheid, de lokale distributie van de chemische elementen, evenals de cellulaire inhoud van nanodeeltjes. Er is een groeiende behoefte aan dergelijke analytische instrumenten binnen de biologie, met name in de nieuwe context van Nanotoxicologie en nanogeneeskunde waarvoor ons begrip van de interacties tussen nanodeeltjes en biologische monsters moet worden verdiept. In het bijzonder, zoals nucleaire microprobe analyse geen nanodeeltjes worden geëtiketteerd vereist, zijn nanoparticle abundanties kwantificeerbaar zodat ze tot op het niveau van de afzonderlijke cel in een celpopulatie, onafhankelijk van hun oppervlakte staat.
Introduction
Cellulaire homeostase wordt bepaald door de controle van de opname, assimilatie en intracellulaire lokalisatie van verschillende sporenelementen (ionen, metalen, exogene anorganische verbindingen). Deze onderdelen zijn vaak in de vorm van sporen, maar toch een aanzienlijke impact kunnen hebben in de Fysiologie van het systeem. De studie van biochemie van de cel in zowel normale als pathologische/benadrukt situaties is dus een sleutel-stap op weg naar een allesomvattend begrip van cellulaire metabole mechanismen. Daarom wordt de ontwikkeling van beeldvorming en analytische technieken waardoor het onderzoek van intracellulaire chemische abundanties, structurele organisatie en hun bijbehorende metabolische functies nodig. Er zijn zeer weinig methoden kunnen bieden van een in situ kwantitatieve stuk van gegevens betreffende de algemene chemische aard van een monster. Naast het analyseren van monsters in de vorm van bulk, analyses- in situ overwegen biologische monsters in hun volledigheid zonder verlies van massale en structurele informatie, waardoor het behoud van hun samenstellende chemische stoffen (sporenelementen en ionen) en eiwitten. Daarnaast, aangezien de nanowetenschappen ontwikkelen blijven, verbeterde beeldvorming en analysemethoden voor milieubewaking cellulaire duurzaame zullen nodig zijn om te observeren en te kwantificeren van nano-object gedrag en interacties. 1
Nanodeeltjes (NPs) zijn gedefinieerd als objecten tentoonstellen van ten minste één gezicht dimensie in het bereik 1 en 100 nm. 2 vanwege hun specifieke fysisch-chemische eigenschappen, NPs worden uitgebreid gebruikt in de industrie. NPs werkzaam zijn in de bio-toepassingen en in de nanogeneeskunde. 3 , 4 ondanks de talrijke fysisch-chemische eigenschappen van de NPs, kunnen ze genereren sommige risico’s van nadelige effecten op de menselijke gezondheid en milieu. Deze risico’s kunnen worden veroorzaakt door zowel langdurige en herhaalde blootstelling op verschillende concentratieniveaus en dit is nog niet duidelijk vastgesteld. 5 , 6 , 7 , 8 In het bijzonder, het lot van NPs binnen cellen en de bijbehorende cellulaire reacties zijn, tot op heden niet volledig beschreven. Dit is gedeeltelijk te wijten aan de schaarste van methoden waarmee de opsporing en kwantificering van verinnerlijkte NPs in één cel. 9
De klassieke analytische instrumenten gebruikt om te schatten de cellulaire dosis van nanodeeltjes zijn microscopies, massaspectrometrie (MS), met inductief gekoppeld plasma (ICP-MS) MS10,11 en vloeistofchromatografie die MS (LC-MS), maar ze alleen bieden nuttige informatie op de macroscopische schaal. Geen enkel van hen kan een precieze evaluatie van de subcellular NPs-inhoud, noch de verdeling van de NPs zonder het gebruik van fractionering methoden aan. Een systematische evaluatie van de dosis-respons is dus onmogelijk met deze methoden, in tegenstelling tot methoden die gebaseerd zijn op atomaire spectroscopie zoals nucleaire microprobe analyse12,13, synchrotron Röntgen fluorescentie microscopie14 , en secundaire Ion massaspectrometrie (SIMS). 15 , 16 deze methoden zijn bijzonder interessant, aangezien ze als aanvulling op de opmerkingen die zijn gemaakt met behulp van fluorescentie microscopie, vooral wanneer NPs niet kunnen worden aangeduid met fluorescerende moleculen en dus in hun oorspronkelijke staat worden bestudeerd. Tot op zekere hoogte zelfs wanneer NPs zijn geënt met fluorophores, blijft (i) kwantificering moeilijk omdat de tagging niveau per NP onbekend is en (ii) de chemische modificatie van het oppervlak van NP de cellulaire verdeling kan wijzigen.
In dit artikel, we concentreren op een methode gebaseerd op een combinatie van nucleaire microprobe technieken die gericht zijn op de morfologie en de elementaire samenstelling van biologische monsters in majeur, mineur, imaging en concentraties te traceren.
Nucleaire microprobe analyse blijkt te zijn met name geschikt voor het meten van chemische sporenelementen in biologische weefsels. Zowel de lichtbundel laterale resolutie (0.3-1 µm) en de gevoeligheid in scheikundig element detectie (van 1 tot 10 µg.g-1 droge massa) zijn geschikt voor studies op cellulair niveau. Nucleaire microprobe technieken zijn gebaseerd op deeltjes detectie (fotonen, elektronen, ionen) uitgezonden nadat de ion beam (meestal uitgevoerd bij MeV energieën) met atomen aanwezig in het monster interageert. Het gaat hoofdzakelijk om interacties in cellen: 1) excitatie/ionisatie van atomen, gevolgd door een emissie van fotonen nadat atomen terug naar hun fundamentele staat; en 2) diffusie van inkomende deeltjes leiden tot veranderingen in hun energie en richting. De meting van allowsthe identificatie van de energie van de uitgestoten deeltjes van atomen betrokken bij de interactie. Voor het uitvoeren van elementen in kaart te brengen, is de ion-microbeam herhaaldelijk gescand over het monster oppervlak, vaak over een oppervlakte van ongeveer 100 per 100 µm-2 met verschillende cellen. Uitgestoten deeltjes worden gedetecteerd en hun energie wordt vastgelegd voor de positie van elke balk. Sorteren van de deeltjes volgens het standpunt van de bundel, is dus het identificeren van de structuur die verantwoordelijk is voor de uitstoot van deze deeltjes het doel van gegevensverwerking. Hier beschrijven we juist een aanpak op basis van fluorescentie microscopie en nucleaire microprobe analyse om te ontdekken, alsmede te kwantificeren van exogene NPs op de cellulaire en sub cellulaire schalen, om te onderzoeken van de gevolgen van NP interacties met levende systemen. We zullen met name richten op de mogelijkheden van deze methode in termen van in situ kwantificering van titaandioxide nanodeeltjes (TiO2 van NPs) aggregaten subcellular niveau.
Protocol
Representative Results
Discussion
Beschrijven we een methode verstrekken van nuttige informatie dan wat mogelijk met andere beeldvormingstechnieken, met name op de subcellular niveau is. Naast haar imaging vermogen biedt nucleaire microprobe analyse ook mogelijkheden voor kwantificering van chemische elementen in te voeren in de samenstelling van een biologische steekproef. In het huidige werk, we onderzocht menselijke cel populaties en gericht tot de analyse van een gekozen gebied van belang op basis van een enkele cel blootgesteld aan TiO2 N…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Serge Borderes voor regie en bewerken van de video. Van het Franse nationale agentschap onderzoek ondersteunt het onderzoeksprogramma TITANIUMS (ANR CES 2010, n ° CESA 009 01). Het CNRS en de Europese Gemeenschap als een activiteit gericht op het integreren verstrekt de “steun voor openbare en industriële onderzoek met behulp van Ion Beam technologie (SPIRIT)” onder de EG contract n ° 227012. Dit werk werd ondersteund door Marie Curie-acties – Initial Training Networks (ITN) als een “integratie van activiteiten ter ondersteuning van postdoctorale onderzoek met stages in industrie en opleiding Excellence” (SPRITE, D1.3) onder EG contract nr. 317169. De C’NANO Grand Sud Ouest en de regio Aquitaine ondersteunen het onderzoeksprogramma TOX-NANO (n ° 20111201003) en het onderzoeksprogramma POPRA (n ° 14006636-034).
Materials
| Cell culture | |||
| U2OS | ATCC, LGC STANDARDS | ATCC HTB-96 | |
| Medium MCCOY 5A w/o L-Glutamine | Dominique DUTSCHER | L0211-500 | |
| FBS 500 mL | Dominique DUTSCHER | 500105U | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 11548876 | |
| L-Glutamine 200 mM, 100 mL | Invitrogen | 25030024 | |
| Geneticin, 20 mL | ThermoFisher Scientific | 10092772 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% (v/v) 500 mL | ThermoFisher Scientific | 11570626 | |
| Viromer Red | Lipocalyx | VR-01LB-01 | |
| Matrix-roGFP Plasmid | AddGene | #49437 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher Scientific | H3570 | Handle with care |
| NPs preparation | |||
| TiO2 P25 AEROXIDE | Degussa/Evonik | ||
| Tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC) | SIGMA-ALDRICH | T3163 | Surface modification of NPs |
| Sample preparation | |||
| Polycarbonate foil | Goodfellow | CT301020 | |
| Polyether Ether Ketone support (PEEK) | Matechplast | A-239-4047 | |
| Ethanol, ACS absolute | SIGMA-ALDRICH | 02860-6x1L | |
| Chlorform, Anhydrous, 99% | SIGMA-ALDRICH | 372978-1L | Caution toxic |
| Formvar 100 g | Agar Scientific | AGR1201 | Harmful. Use in a concentration of 10 µg per mL of chloroform |
| NaOH | SIGMA-ALDRICH | S5881-500G | |
| Sample fixation | |||
| Powder, 95% Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | 158127-500G | Caution toxic. Use as a 4% solution in PBS |
| PBS (pH 7.4, without Ca2+ and Mg2+) | ThermoFisher Scientific | 11503387 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent | ThermoFisher Scientific | P36934 | |
| Triton X-100 | SIGMA-ALDRICH | 93443 | Harmful |
| Sample cryofixation | |||
| Liquid nitrogen | air liquids sante | Harmful | |
| Methylbutane >=99% | SIGMA-ALDRICH | M32631-1L | Caution toxic |
| Aluminium transfer plate | Home-made | ||
| Distilled and deionized water | Home-made | Produced in the laboratory using the Barnstead Smart2Pure system | |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | |
| Equipment | |||
| Barnstead Smart2Pure | ThermoFisher Scientific | 50129870 | |
| Biosafety bench, class II | ThermoFisher Scientific | MSC-Advantage | |
| TC20 automated cell counter | Biorad | 145-0102SP | |
| Counting slides 2 wells | Biorad | 1450016 | |
| PIPS detector, 25 mm2, 12 keV energy resolution @5.5 MeV | Canberra | PD25-12-100AM | |
| High-resolution Si (Li) solid-state detector,145-eVenergy resolution, @Mn-Kα | Oxford Instruments | ||
| Everhart-Thornley type secondary electron detector (SED) | Orsay Physics | 1-SED | |
| XRF Calibration Standard sodium or Chlorine as NaCl | Micromatter | 34381 | |
| XRF Calibration Standard Magnesium as MgF2 | Micromatter | 34382 | |
| XRF Calibration Standard Aluminium as Al metal | Micromatter | 34383 | |
| XRF Calibration Standard Silicon as SiO | Micromatter | 34384 | |
| XRF Calibration Standard Sulfur as CuSx | Micromatter | 34385 | |
| XRF Calibration Standard Calcium as CaF2 | Micromatter | 34387 | |
| XRF Calibration Standard Titanium as Ti metal | Micromatter | 34388 | |
| XRF Calibration Standard Iron as Fe metal | Micromatter | 34389 | |
| Sonicator 750W | Sonics Materials | 11743619 | |
| 3MM microprobe | Bioblock scientific | 220-05 | |
| Lyophilizer in vacuum | Elexience | EK3147 | |
| Optical microscope Zeiss AxioObserver Z1 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 431006-9901 | |
| Motorized stage xy | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 432031-9902 | |
| EC Plan-Neofluar 20X, NA 0.50 Ph2 M27 objective | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 420351-9910 | |
| Plan-Apochromat 63X, NA 1,40 Ph3M27 objective | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 420781-9910 | |
| Zeiss filterset 02 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 488002-9901 | |
| Zeiss filterset 38HE | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 489038-9901 | |
| Zeiss filterset 31 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 000000-1031-350 | |
| Chemical fume hood | Erlab | Captair SD321 | |
| Particle accelerator | HVEE | singletron | |
| Software | |||
| ImageJ software | National Institutes of health, USA | ImageJ 1.51 | |
| SimNRA software | Max-Planck-Institut für Plasmaphysik, Germany | SIMNRA 6.06 | |
| Gupix software | Guelph university, Canada | GUPIXWIN 2.2.4 |
References
- Krug, H. F., Wick, P. Nanotoxicology: An Interdisciplinary Challenge. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (6), 1260-1278 (2011).
- Van Hove, M. A. From surface science to nanotechnology. Catalysis Today. 113 (3-4), 133-140 (2006).
- Le Trequesser, Q., Seznec, H., Delville, M. H. Functionalized nanomaterials: their use as contrast agents in bioimaging: mono- and multimodal approaches. Nanotox. Rev. 2 (2), 125-169 (2013).
- Oberdorster, G. Safety assessment for nanotechnology and nanomedicine: concepts of nanotoxicology. J. Int. Med. , 89-105 (2009).
- Savolainen, K., et al. Nanotechnologies, engineered nanomaterials and occupational health and safety – A review. Saf. Sci. 48 (8), 957-963 (2010).
- Savolainen, K., Alenius, H., Norppa, H., Pylkkanen, L., Tuomi, T., Kasper, G. Risk assessment of engineered nanomaterials and nanotechnologies – A review. Toxicol. 269 (2-3), 92-104 (2010).
- Arora, S., Rajwade, J. M., Paknikar, K. M. Nanotoxicology and in vitro studies: The need of the hour. Toxicol. . Appl. Pharm. 258 (2), 151-165 (2012).
- Donaldson, K. Resolving the nanoparticles paradox. Future Med. 1 (2), 229-234 (2006).
- Schaumann, G. E., et al. Understanding the fate and biological effects of Ag- and TiO2-nanoparticles in the environment: The quest for advanced analytics and interdisciplinary concepts. Sci Total Environ. 535, 3-19 (2014).
- Olesik, J. W. . Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometers. Treatise on Geochemistry. , (2014).
- Krystek, P. A review on approaches to bio-distribution studies about gold and silver engineered nanoparticles by inductively coupled plasma mass spectrometry. Microchem. J. 105 (November 2011), 39-43 (2012).
- Le Trequesser, Q., et al. Multimodal correlative microscopy for in situ detection and quantification of chemical elements in biological specimens. Applications to nanotoxicology. J .Chem. Biol. 8 (4), 159-167 (2015).
- Le Trequesser, Q., et al. Single cell in situ detection and quantification of metal oxide nanoparticles using multimodal correlative microscopy. Anal. Chem. 86 (15), 7311-7319 (2014).
- Ackermann, C. M., Lee, S., Chang, C. J. Analytical Methods for Imaging Metals in Biology: From Transition Metal Metabolism to Transition Metal Signaling. Anal. Chem. 89 (1), 22-41 (2017).
- Legin, A. A., et al. NanoSIMS combined with fluorescence microscopy as a tool for subcellular imaging of isotopically labeled platinum-based anticancer drugs. Chem. Sci. 5, 3135 (2014).
- Lanni, E. J., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. Mass spectrometry imaging and profiling of single cells. J. Proteomics. 75 (16), 5036-5051 (2012).
- Waypa, G. B., et al. Hypoxia triggers subcellular compartmental redox signaling in vascular smooth muscle cells. Circ. Res. 106 (3), 526-535 (2010).
- Dooley, C. T., et al. Imaging Dynamic Redox Changes in Mammalian Cells with Green Fluorescent Protein Indicators. J. Biol. Chem. 279 (21), 22284-22293 (2004).
- Hanson, G. T., et al. Investigating Mitochondrial Redox Potential with Redox-sensitive Green Fluorescent Protein Indicators. J. Biol. Chem. 279 (13), 13044-13053 (2004).
- Chen, X., Mao, S. S. Titanium dioxide nanomaterials: Synthesis, properties, modifications and applications. Chem. Rev. 107 (7), 2891-2959 (2007).
- Simon, M., Barberet, P., Delville, M. H., Moretto, P., Seznec, H. Titanium dioxide nanoparticles induced intracellular calcium homeostasis modi fi cation in primary human keratinocytes. Towards an in vitro explanation of titanium dioxide nanoparticles toxicity. Nanotox. 5 (June), 125-139 (2011).
- Sorieul, S., et al. An ion beam facility for multidisciplinary research. Nucl. Instr. Meth. Phys. Res., B. 332, 68-73 (2014).
- Barberet, P., et al. First results obtained using the CENBG nanobeam line: Performances and applications. Nucl Instr Meth Phys Res B. 269 (20), 2163-2167 (2011).
- Devès, G., et al. An ImageJ plugin for ion beam imaging and data processing at AIFIRA facility. Nucl. Instr. Meth. Phys. Res. B. 348, 62-67 (2015).
- Mayer, M. . SIMNRA User’s Guide, Report IPP 9/113. , (1997).
- Campbell, J. L., Boyd, N. I., Grassi, N., Bonnick, P., Maxwell, J. A. The Guelph PIXE software package IV. Nucl. Instr. Meth. Phys. Res. B. 268 (20), 3356-3363 (2010).
- Yu, K., Chang, S., Park, S. J., Lim, J., Lee, J. Titanium Dioxide Nanoparticles Induce Endoplasmic Reticulum Stress-Mediated Autophagic Cell Death via Mitochondria- Associated Endoplasmic Reticulum Membrane Disruption in Normal Lung Cells. PLoS ONE. , 1-17 (2015).
