In Situ Détection et Quantification de la cellule unique de nanoparticules d’oxyde métallique à l’aide de l’analyse par microsonde nucléaire
Summary
Nous décrivons une procédure pour la détection des éléments chimiques présents in situ dans les cellules humaines, mais aussi leur quantification in vitro . La méthode est bien adaptée à tout type de cellule et est particulièrement utile pour des analyses chimiques quantitatives dans des cellules individuelles après in vitro l’exposition nanoparticules d’oxyde métallique.
Abstract
Micro-analytical techniques basées sur l’imagerie de l’élément chimique permettent la localisation et quantification de composition chimique au niveau cellulaire. Ils offrent de nouvelles possibilités pour la caractérisation des systèmes vivants et sont particulièrement adaptés pour détecter, localiser et quantifier la présence de nanoparticules d’oxyde METALLIQUE en spécimens biologiques et l’environnement. En effet, ces techniques de toutes les exigences correspondantes en matière de (i) la sensibilité (de 1 à 10 µg.g-1 de masse sèche), résolution spatiale de gamme micromètre (ii) et (iii) multi-éléments détection. Compte tenu de ces caractéristiques, imagerie élément chimique microfaisceaux peut puissamment compléter les techniques d’imagerie courants tels qu’optique et microscopie de fluorescence. Ce protocole décrit comment effectuer une analyse par microsonde nucléaire sur des cellules cultivées (U2OS) exposés à des nanoparticules de dioxyde de titane. Les cellules doivent grandir et être exposés directement dans un porte-échantillon spécialement conçu pour utiliser le microscope optique et dans les étapes de l’analyse par microsonde nucléaire. Plongée-gel fixation cryogénique des échantillons conserve l’organisation cellulaire et la distribution des éléments chimiques. Analyse simultanée microsonde nucléaire (microscopie ionique de transmission, de rétrodiffusion de Rutherford et de particule induite par émission de rayons x) effectuée sur l’échantillon fournit des informations sur la densité cellulaire, la distribution locale des les éléments chimiques, ainsi que le contenu cellulaire des nanoparticules. Il y a un besoin croissant de ces outils analytiques au sein de la biologie, en particulier dans le contexte émergent Nanotoxicologie et nanomédecine pour lesquels notre compréhension des interactions entre les nanoparticules et les échantillons biologiques doit être approfondie. En particulier, comme l’analyse par microsonde nucléaire ne nécessite pas de nanoparticules d’être étiquetés, abondance de nanoparticules est quantifiables jusqu’au niveau des cellules individuelles dans une population de cellules, indépendamment de leur état de surface.
Introduction
Homéostasie cellulaire est déterminée par le contrôle de l’absorption, l’assimilation et la localisation intracellulaire de différents oligo-éléments (ions, métaux, composés inorganiques exogènes). Ces composants sont souvent sous forme de traces, mais néanmoins, peuvent avoir un impact considérable dans la physiologie du système. Ainsi, l’étude de la biochimie cellulaire dans des situations normales et pathologiques/a souligné est une étape-clé vers une compréhension globale des mécanismes métaboliques cellulaires. Par conséquent, le développement des techniques d’imagerie et d’analyses permettant à l’enquête d’abondances chimiques intracellulaires, organisation structurale et leurs fonctions métaboliques associées devient nécessaire. Méthodes très peu sont en mesure de fournir un élément quantitative in situ d’information concernant la nature dans l’ensemble chimique d’un échantillon donné. En dehors des méthodes d’analyse d’échantillons sous la forme de vrac, in situ analyses examiner des échantillons biologiques dans leur intégralité sans perte d’informations de massives et structurelles, afin de préserver leurs composants chimiques (oligo-éléments et ions) et protéines. En outre, comme les nanosciences continuent de développer, imagerie améliorée et les méthodes d’analyse pour la surveillance environnementale à l’échelle cellulaire devra observer et quantifier les interactions et les comportements de nano-objet. 1
Nanoparticles (NPs) ont été définis en tant qu’objets présentant au moins une dimension du visage dans la gamme 1 et 100 nm. 2 en raison de leurs propriétés physicochimiques particulières, NPs sont largement utilisés dans l’industrie. NPs sont employés dans les bio-applications et en nanomédecine. 3 , 4 malgré les nombreuses caractéristiques physico-chimiques du NPs, ils peuvent générer des risques d’effets nocifs sur la santé humaine et l’environnement. Ces risques peuvent être induites par l’exposition prolongée et répétée à divers niveaux de concentration et cela n’a pas encore été clairement établie. 5 , 6 , 7 , 8 en particulier, le sort de NPs à l’intérieur des cellules et les réponses cellulaires associées sont, à ce jour, pas entièrement décrit. C’est en partie en raison de la rareté des méthodes qui permettent la détection et la quantification du NPs intériorisées dans une seule cellule. 9
Les outils analytiques classiques utilisées pour estimer la dose cellulaire des nanoparticules sont microscopies, spectrométrie de masse (MS), couplage inductif plasma MS (ICP-MS)10,11 et la chromatographie en phase liquide que MS (LC-MS), mais ils ne donnent informations utiles à l’échelle macroscopique. Aucun d’eux ne peut fournir une évaluation précise de la teneur de NPs subcellulaire ni la distribution de NPs sans avoir recours à des méthodes de fractionnement. Une évaluation systématique de la relation dose-effet est donc impossible avec ces méthodes, par opposition aux méthodes basées sur la spectroscopie atomique comme microsonde nucléaire analyse12,13, microscopie de fluorescence de rayons x synchrotron14 et spectrométrie de masse à ions secondaires (SIMS). 15 , 16 ces méthodes sont particulièrement intéressants car ils complètent les observations faites à l’aide de la microscopie en fluorescence, surtout lorsque NPs ne peut pas être étiquetés avec des molécules fluorescentes et sont ainsi étudiés dans leur état natif. Dans une certaine mesure, même lorsque NPs sont greffés avec des fluorophores, (i) quantification reste difficile parce que ne connaît pas le niveau de marquage par NP et (ii) la modification chimique de la surface de la NP peut modifier sa distribution cellulaire.
Dans cet article, nous nous concentrons sur une méthode basée sur une combinaison de techniques de microsonde nucléaire visant à l’imagerie de la morphologie et la composition élémentaire des spécimens biologiques en majeur, mineur et tracer les concentrations.
Analyse par microsonde nucléaire s’avère particulièrement adapté pour la mesure des éléments chimiques dans les tissus biologiques. La résolution latérale de faisceau (0,3 à 1 µm) et la sensibilité dans la détection de l’élément chimique (de 1 à 10 µg.g poids sec-1 ) sont bien adaptés pour des études au niveau cellulaire. Microsonde nucléaire techniques sont basées sur la détection de particules (photons, électrons, ions) émise après que le faisceau d’ions (en général fonctionnant aux énergies MeV) interagit avec les atomes présents dans l’échantillon. Les interactions qui se produisent dans les cellules sont principalement : 1) excitation/ionisation des atomes, suivie d’une émission de photons après atomes retournent à leur état fondamental ; et 2) diffusion des particules incidentes conduisant au changement dans l’énergie et de la direction. La mesure de la particule émise énergie allowsthe identification des atomes impliqués dans l’interaction. Pour effectuer le mappage des éléments, le microfaisceaux d’ions est à plusieurs reprises analysé sur la surface de l’échantillon, souvent sur une superficie d’environ 100 par 100 µm2 contenant plusieurs cellules. Particules émises sont détectés et leur énergie est enregistré pour chaque position du faisceau. Tri des particules selon la position du faisceau, identifiant ainsi la structure responsable de l’émission de ces particules est le but du traitement des données. Nous décrivons ici précisément une approche basée sur la microscopie par fluorescence et analyse par microsonde nucléaire pour détecter mais aussi de quantifier NPs exogènes à l’échelle cellulaire et subcellulaire, afin d’enquêter sur les conséquences des interactions NP avec la vie systèmes. Nous nous concentrerons particulièrement sur les possibilités offertes par cette méthode en termes in situ la quantification des rejets de dioxyde de titane (TiO2 NPs) des nanoparticules agrégats au niveau subcellulaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les auteurs décrivent une méthode fournissant des informations utiles au-delà de ce qui est possible avec d’autres techniques d’imagerie, notamment au niveau subcellulaire. Outre sa capacité d’imagerie, analyse par microsonde nucléaire offre aussi des possibilités de dosage d’éléments chimiques entrant dans la composition d’un échantillon biologique. Dans le présent travail, nous avons étudié des populations de cellules humaines et axé vers le bas pour l’analyse d’une région choisie d’intér…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Serge Borderes pour réalisation et montage de la vidéo. L’Agence nationale de recherche Français prend en charge le programme de recherche Titanes (ANR CES 2010, n ° CESA 009 01). Le CNRS et la Communauté européenne comme une activité d’intégration fourni le « soutien du Public et recherche utilisant Ion faisceau technologie (esprit industriel) » en vertu de ce contrat n ° 227012. Ce travail a été soutenu par Actions Marie Curie – réseaux de formation initiale (ITN) comme un « intégrant activité soutenant Postgraduate avec stages en industrie et formation Excellence en recherche » (SPRITE, D1.3) sous contrat EC No 317169. Le C’NANO Grand Sud Ouest et la région Aquitaine prend en charge le programme de recherche TOX-NANO (n ° 20111201003) et le programme de recherche POPRA (n ° 14006636-034).
Materials
| Cell culture | |||
| U2OS | ATCC, LGC STANDARDS | ATCC HTB-96 | |
| Medium MCCOY 5A w/o L-Glutamine | Dominique DUTSCHER | L0211-500 | |
| FBS 500 mL | Dominique DUTSCHER | 500105U | |
| Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher Scientific | 11548876 | |
| L-Glutamine 200 mM, 100 mL | Invitrogen | 25030024 | |
| Geneticin, 20 mL | ThermoFisher Scientific | 10092772 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% (v/v) 500 mL | ThermoFisher Scientific | 11570626 | |
| Viromer Red | Lipocalyx | VR-01LB-01 | |
| Matrix-roGFP Plasmid | AddGene | #49437 | |
| Hoechst 33342 | ThermoFisher Scientific | H3570 | Handle with care |
| NPs preparation | |||
| TiO2 P25 AEROXIDE | Degussa/Evonik | ||
| Tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC) | SIGMA-ALDRICH | T3163 | Surface modification of NPs |
| Sample preparation | |||
| Polycarbonate foil | Goodfellow | CT301020 | |
| Polyether Ether Ketone support (PEEK) | Matechplast | A-239-4047 | |
| Ethanol, ACS absolute | SIGMA-ALDRICH | 02860-6x1L | |
| Chlorform, Anhydrous, 99% | SIGMA-ALDRICH | 372978-1L | Caution toxic |
| Formvar 100 g | Agar Scientific | AGR1201 | Harmful. Use in a concentration of 10 µg per mL of chloroform |
| NaOH | SIGMA-ALDRICH | S5881-500G | |
| Sample fixation | |||
| Powder, 95% Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | 158127-500G | Caution toxic. Use as a 4% solution in PBS |
| PBS (pH 7.4, without Ca2+ and Mg2+) | ThermoFisher Scientific | 11503387 | |
| Prolong Gold Antifade Reagent | ThermoFisher Scientific | P36934 | |
| Triton X-100 | SIGMA-ALDRICH | 93443 | Harmful |
| Sample cryofixation | |||
| Liquid nitrogen | air liquids sante | Harmful | |
| Methylbutane >=99% | SIGMA-ALDRICH | M32631-1L | Caution toxic |
| Aluminium transfer plate | Home-made | ||
| Distilled and deionized water | Home-made | Produced in the laboratory using the Barnstead Smart2Pure system | |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | |
| Equipment | |||
| Barnstead Smart2Pure | ThermoFisher Scientific | 50129870 | |
| Biosafety bench, class II | ThermoFisher Scientific | MSC-Advantage | |
| TC20 automated cell counter | Biorad | 145-0102SP | |
| Counting slides 2 wells | Biorad | 1450016 | |
| PIPS detector, 25 mm2, 12 keV energy resolution @5.5 MeV | Canberra | PD25-12-100AM | |
| High-resolution Si (Li) solid-state detector,145-eVenergy resolution, @Mn-Kα | Oxford Instruments | ||
| Everhart-Thornley type secondary electron detector (SED) | Orsay Physics | 1-SED | |
| XRF Calibration Standard sodium or Chlorine as NaCl | Micromatter | 34381 | |
| XRF Calibration Standard Magnesium as MgF2 | Micromatter | 34382 | |
| XRF Calibration Standard Aluminium as Al metal | Micromatter | 34383 | |
| XRF Calibration Standard Silicon as SiO | Micromatter | 34384 | |
| XRF Calibration Standard Sulfur as CuSx | Micromatter | 34385 | |
| XRF Calibration Standard Calcium as CaF2 | Micromatter | 34387 | |
| XRF Calibration Standard Titanium as Ti metal | Micromatter | 34388 | |
| XRF Calibration Standard Iron as Fe metal | Micromatter | 34389 | |
| Sonicator 750W | Sonics Materials | 11743619 | |
| 3MM microprobe | Bioblock scientific | 220-05 | |
| Lyophilizer in vacuum | Elexience | EK3147 | |
| Optical microscope Zeiss AxioObserver Z1 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 431006-9901 | |
| Motorized stage xy | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 432031-9902 | |
| EC Plan-Neofluar 20X, NA 0.50 Ph2 M27 objective | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 420351-9910 | |
| Plan-Apochromat 63X, NA 1,40 Ph3M27 objective | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 420781-9910 | |
| Zeiss filterset 02 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 488002-9901 | |
| Zeiss filterset 38HE | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 489038-9901 | |
| Zeiss filterset 31 | Carl Zeiss MicroImaging, GmbH | 000000-1031-350 | |
| Chemical fume hood | Erlab | Captair SD321 | |
| Particle accelerator | HVEE | singletron | |
| Software | |||
| ImageJ software | National Institutes of health, USA | ImageJ 1.51 | |
| SimNRA software | Max-Planck-Institut für Plasmaphysik, Germany | SIMNRA 6.06 | |
| Gupix software | Guelph university, Canada | GUPIXWIN 2.2.4 |
References
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