宽吻海豚 (海豚截形) 精子： 收集、 冷冻保存和外源体外受精
Summary
在这里，我们目前成功地用于海豚精子收集、 冷冻保存和异源使用牛卵母细胞的体外受精效果的协议。
Abstract
深低温保存的海豚精子的使用促进水生公园之间的遗传材料的交换，并使精子可到实验室进行研究，以进一步加深对海洋哺乳动物繁殖。外源体外受精，更换为异体受精，可以提供一种手段来测试精子生育潜力;研究生理学配子和胚胎的早期发育;和避免使用宝贵的海豚卵，很难获得。在这里，我们目前已成功地用于收集和海豚精子冷冻保存的协议。集合的精子进行人工刺激对经过训练的海豚。超低温保存是甘油使用三蛋黄基于扩展程序完成的。另外，我们提出一种协议，它描述使用海豚精子和牛卵母细胞的异种受精和用于验证所产生的胚胎，应用 pcr 技术的混合性质。异体受精提出了施肥的问题，可以作为一种工具用于研究配子生理学和早期胚胎发育。此外，异体受精成功演示这种技术的潜力，来测试海豚精子受精能力，值得进一步的检查。
Introduction
辅助生殖技术在野生动物，包括海洋哺乳动物发育不良。缺乏敏感的方法，以评估精子受精成功贡献的物种，如海豚生殖技术发展缓慢。它不是直到最近的宽吻海豚 (海豚截形) 基本精参数是报告的1，2。但是，变量，如运动和形态，虽然广泛应用，给生殖效率的资料有限。精子质量的最佳指标是施肥潜力的评价。
最近，我们小组用一种方法来评估海豚精子通过评估雄原核形成和/或混合胚胎形成异源体外受精使用透明完整牛卵母细胞3后的施肥的潜力。海豚-牛异体受精使用作为它克服困难获得海豚卵母细胞的重要优点同源的体外受精，并有助于行之有效体外牛卵母细胞成熟系统的使用。为了避免种属特异性，异体受精通常被执行不到位的 ZP。虽然它允许对精子顶体反应的精子与卵黄膜融合的能力的评价，它损害的评价与施肥相关的其他功能。所述的过程使用透明完整卵母细胞和允许下列参数评价： 精子卵具约束力和附件、 渗透、 多精受精、 原核形成和混合胚胎卵裂。
在这里，我们目前为精子集合、 基本精子分析、 精子冷冻的海豚精子功能评价的几种协议通过评估雄性原核和/或混合胚胎的形成异源体外受精后使用透明完整牛卵母细胞。
Protocol
Representative Results
Discussion
对于许多不同的哺乳类动物，有多样的优势，以利用冷冻精子。这些包括转移宝贵的遗传材料、 潜在的全球分布、 污染、 低风险和几十年来保持雄性配子的能力的能力。利用冷冻精子的宽吻海豚，至关重要，因为这一物种保护下附录 II 的引证，限制的运输和交换的动物之间不同的水上公园。海豚运输是创建后勤问题和危险的活动。然而，避免运送他们也有的后果，例如引入到动物圈养种群的血…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
他的工作是由经济和竞争力 (AGL2015-70140-R 的 D.Rizos)、 AGL2015 66145R A.古铁雷斯阿丹和 J.F.· 佩雷斯 · 古铁雷斯和塞内卡穆尔西亚基金会 (格兰特 20040/胚芽/16 F.加西亚 · 巴斯克斯) 西班牙语部资助的。
Materials
| FERT-TALP medium | Merck | |
| TCM-199 | Sigma | M-4530 |
| Hoechst 33342 | Sigma | B-2261 |
| 4-well dishes | Nunc | 176740 |
| Density gradient BoviPure | Nidacon International | BP-100 |
| Washing solution Boviwash | Nidacon International | BW-100 |
| Magnesium chloride | Promega | A35 1H |
| Sterile water | Mili Q sintesis A10 Millipore | A35 1H |
| Buffer Tris Borate EDTA | Sigma | T4415 |
| MB agarose | Biotools | 20.012 |
| 5X GoTaq flexi buffer | Mili Q sintesis A10 Millipore | M 890 A |
| MB agarose | Biotools | 20.012 |
| Taq polymerase | Promega | |
| SafeView | NBS Biologicals Ltd. | M 890 A |
| Makler counting chamber | Sefi Medical | |
| Thoma chamber | Hecht-Assistant | |
| pHmeter MicropH 2000 | Crison Instruments | |
| Osmometer Advanced micro osmometer 3300 | Norwood | |
| Computer assisted sperm analysis system | Projectes y Serveis R+D | |
| Stereomicroscope MZ 95 | Leica | |
| Epifluorescent optics Eclipse Te300 | Nikon | |
| Confocal assistant 4.02 software | Bio-Rad | 3D analysis software |
| Confocal laser scanning microscopy | Bio-Rad | |
| Micropippetes (P2. P20, P200, P1000) | Gilson | |
| Microcentrifuge tubes | VWR | |
| UV iluminator | Bio-Rad | |
| PCR Thermal cycler Primus 96 Plus | MWG AG Biotech |
References
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