Bottlenose dolfijn (Tursiops truncatus) Spermatozoa: collectie, cryopreservatie en heterologe In Vitro bevruchting
Summary
Hier presenteren we protocollen die met succes zijn gebruikt voor dolphin spermacellen collectie, cryopreservatie en heterologe IVF-prestaties met boviene eicellen.
Abstract
Het gebruik van de cryopreserved dolfijn spermacellen vergemakkelijkt de uitwisseling van genetisch materiaal tussen aquatische parken en spermacellen toegankelijk maakt voor laboratoria voor studies om ons begrip van zeezoogdieren reproductie. Heterologe IVF, een vervanging voor homologe IVF, kan dienen als een middel om te testen de sperma vruchtbaarheid potentiële; studie gameet fysiologie en vroege embryo-ontwikkeling; en om te voorkomen dat het gebruik van waardevolle dolfijn eicellen, die moeilijk te verkrijgen. Hier presenteren we de protocollen die zijn geopend met succes cryopreserve dolfijn spermacellen te verzamelen. Het verzamelen van sperma wordt uitgevoerd door handmatige stimulatie bij getrainde dolfijnen. Cryopreservatie wordt bereikt met behulp van een TRIS-ei-dooier gebaseerd extender met glycerol. Daarnaast presenteren wij een protocol die beschrijft heterologe IVF met dolfijn spermacellen en eicellen van runderen en die wordt gecontroleerd of het hybride karakter van het resulterende embryo met behulp van PCR. Heterologe bevruchting roept vragen op over bevruchting en kan worden gebruikt als een instrument gameet fysiologie en vroege embryo-ontwikkeling te gaan studeren. Bovendien, toont het succes van heterologe IVF het potentieel van deze techniek voor het testen van de dolfijn sperma Bemestings-capaciteit, die is de moeite waard nader onderzoek.
Introduction
Geassisteerde voortplanting technologieën zijn slecht ontwikkeld in wilde dieren, met inbegrip van mariene zoogdieren. Het ontbreken van gevoelige methoden voor het beoordelen van sperma waardegevende bestanddelen succes draagt bij aan de trage ontwikkeling van reproductieve technologieën in soorten zoals dolfijnen. Het was niet tot voor kort dat de rudimentaire basisparameters van de Tuimelaar (Tursiops truncatus) gerapporteerde1,2 waren. Variabelen zoals de motiliteit en morfologie, geven hoewel op grote schaal gebruikt, echter beperkte informatie over reproductieve efficiëntie. De beste indicator van de kwaliteit van het sperma is de evaluatie van de waardegevende bestanddelen potentieel.
Onlangs, onze fractie gebruikt een methode ter beoordeling van de dolfijn sperma Bemestings-potentieel door mannelijke pronuclear vorming en/of hybride embryo vorming na heterologe IVF met zona intact boviene eicellen3te bepalen. Het gebruik van dolfijn-runderen heterologe IVF heeft belangrijke voordelen ten opzichte van homologe IVF, zoals het overwint de moeilijkheidsgraad van het verkrijgen van eicellen van de dolfijn en vergemakkelijkt het gebruik van goed getest in vitro boviene oöcyt rijping systemen. Om te voorkomen dat soorten specificiteit, is heterologe bevruchting algemeen uitgevoerd bij gebrek aan ZP. Hoewel het mogelijk voor de evaluatie van het vermogen van de spermacellen Acrosoom-gereageerd om te fuseren met het vitelline membraan maakt, schaadt het de evaluatie van andere kenmerken in verband met bemesting. De beschreven procedure maakt gebruik van zona intact eicellen en vergunningen van de evaluatie van de volgende parameters: sperma zona bindende en bijlage, penetratie, polyspermy, pronuclear formatie en hybride embryo decollete.
Hier, presenteren wij diverse protocollen voor sperma collectie, fundamentele sperma-analyse, spermacellen bevriezing, alsmede de evaluatie van de dolfijn sperma functionaliteit door mannelijke pronuclear en/of hybride embryo vorming na heterologe IVF te bepalen met behulp van zona intact boviene eicellen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Voor veel verschillende soorten zoogdieren zijn er verschillende voordelen aan het gebruik van bevroren-ontdooid sperma. Het gaat hierbij om de mogelijkheid om de overdracht van waardevol genetisch materiaal, het potentieel voor wereldwijde distributie, het geringe risico van verontreiniging en het vermogen om te bewaren van mannelijke gameten voor decennia. Het gebruik van cryopreserved sperma is essentieel voor de Tuimelaar, want deze soort is beschermd op grond van bijlage II van CITES, waardoor het transport en de ui…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
zijn werk werd gefinancierd door het Spaanse ministerie van economie en concurrentie (AGL2015-70140-R naar D. Rizos), AGL2015-66145R A. Gutierrez-Adan en J. F. Pérez-Gutiérrez en Seneca Stichting van Murcia (Grant 20040/kiem/16 naar F. García-Vázquez)
Materials
| FERT-TALP medium | Merck | |
| TCM-199 | Sigma | M-4530 |
| Hoechst 33342 | Sigma | B-2261 |
| 4-well dishes | Nunc | 176740 |
| Density gradient BoviPure | Nidacon International | BP-100 |
| Washing solution Boviwash | Nidacon International | BW-100 |
| Magnesium chloride | Promega | A35 1H |
| Sterile water | Mili Q sintesis A10 Millipore | A35 1H |
| Buffer Tris Borate EDTA | Sigma | T4415 |
| MB agarose | Biotools | 20.012 |
| 5X GoTaq flexi buffer | Mili Q sintesis A10 Millipore | M 890 A |
| MB agarose | Biotools | 20.012 |
| Taq polymerase | Promega | |
| SafeView | NBS Biologicals Ltd. | M 890 A |
| Makler counting chamber | Sefi Medical | |
| Thoma chamber | Hecht-Assistant | |
| pHmeter MicropH 2000 | Crison Instruments | |
| Osmometer Advanced micro osmometer 3300 | Norwood | |
| Computer assisted sperm analysis system | Projectes y Serveis R+D | |
| Stereomicroscope MZ 95 | Leica | |
| Epifluorescent optics Eclipse Te300 | Nikon | |
| Confocal assistant 4.02 software | Bio-Rad | 3D analysis software |
| Confocal laser scanning microscopy | Bio-Rad | |
| Micropippetes (P2. P20, P200, P1000) | Gilson | |
| Microcentrifuge tubes | VWR | |
| UV iluminator | Bio-Rad | |
| PCR Thermal cycler Primus 96 Plus | MWG AG Biotech |
References
- Montano, G. A., et al. Evaluation of motility, membrane status and DNA integrity of frozen-thawed bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa after sex-sorting and recryopreservation. Reproduction. 143 (6), 799-813 (2012).
- Sánchez-calabuig, M. J., et al. Validation of a field based chromatin dispersion assay to assess sperm DNA fragmentation in the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Reprod Domest Anim. 49 (5), 761-768 (2014).
- Sánchez-calabuig, M. J., et al. Heterologous murine and bovine IVF using bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa. Theriogenology. 84 (6), 983-994 (2015).
- Keller, K. V. Training of the Atlantic bottlenose dolphins (Tursiops truncatus) for artificial insemination. IAAAM. 14 (22), 22-24 (1986).
- Robeck, T. R., O’brien, J. K. Effect of cryopreservation methods and precryopreservation storage on bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa. Biol Reprod. 70 (5), 1340-1348 (2004).
- Coy, P., et al. Hardening of the zona pellucida of unfertilized eggs can reduce polyspermic fertilization in the pig and cow. Reproduction. 135 (1), 19-27 (2008).
- Seager, S., W, G., Moore, L., Platz, C., Kirby, V. Semen collection (electroejaculation), evaluation and freezing in the Atlantic bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Proceedings of the American Association of Zoo Veterinarians. 136, (1981).
- Schroeder, J. P., Leatherwood, S., Reeves, R. R. Breeding Bottlenose Dolphins in captivity. The Bottlenose dolphin. , 447-460 (1990).
- Sánchez-Calabuig, M. J., et al. Effect of cryopreservation on the sperm DNA fragmentation dynamics of the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Reprod Domest Anim. 50 (2), 227-235 (2015).
- Robeck, T. R., et al. Estrous cycle characterisation and artificial insemination using frozen-thawed spermatozoa in the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Reproduction. 129 (5), 659-674 (2005).
- Robeck, T. R., et al. Development and evaluation of deep intra-uterine artificial insemination using cryopreserved sexed spermatozoa in bottlenose dolphins (Tursiops truncatus). Anim Reprod Sci. 139 (1-4), 168-181 (2013).
- Schroeder, J. P., Leatherwood, S., Reeves, R. R. Breeding Bottlenose Dolphins in captivity. The Bottlenose dolphin. , 447-460 (1990).
- Madeddu, M., et al. Effect of cooling rate on the survival of cryopreserved rooster sperm: Comparison of different distances in the vapor above the surface of the liquid nitrogen. Anim Reprod Sci. , (2016).
