Şişe burunlu yunus (Tursiops truncatus) sperm: koleksiyon, dondurma ve kapaklı In Vitro fertilizasyon
Summary
Burada, Yunus sperm toplama, dondurma ve sığır yumurta kullanarak kapaklı tüp bebek performansı için başarılı bir şekilde kullanılmıştır protokolleri mevcut.
Abstract
Cryopreserved yunus sperm kullanımı su parkları arasında genetik malzeme alışverişini kolaylaştırır ve sperm hücreleri laboratuarlar anlayışımız Deniz memelileri üreme daha ileri çalışmalar için hale getirmektedir. Kapaklı tüp bebek, yerine homolog tüp bebek, sperm doğurganlık potansiyel test etmek için bir araç sağlayabilir; çalışma gamet fizyolojisi ve erken embriyo gelişimi için; ve elde etmek zordur değerli yunus yumurta kullanmaktan kaçının. Burada, başarılı bir şekilde toplamak ve yunus sperm elde cryopreserve için kullanılmış olan protokolleri mevcut. Sperm toplama eğitimli yunuslar üzerinde el ile stimülasyon tarafından gerçekleştirilir. Dondurma TRIS yumurta sarısı dayalı extender gliserol ile kullanılarak yapılır. Buna ek olarak, biz bir protokolü kapaklı tüp bebek yunus sperm hücreleri ve sığır yumurta kullanarak açıklar ve PCR kullanarak elde edilen embriyo hibrid doğası doğrular mevcut. Kapaklı döllenme fertilizasyon tarih soruları yanıtlayan ve çalışma gamet fizyolojisi ve erken embriyo gelişimi için bir araç olarak kullanılabilir. Buna ek olarak, kapaklı tüp bebek başarı daha fazla muayene olan kapasitesi, gübreleme yunus sperm test etmek için bu teknik potansiyelini gösterir.
Introduction
Yardımlı üreme teknikleri kötü vahşi hayvanlar, Deniz memelileri de dahil olmak üzere geliştirilir. Hassas yöntemler sperm Gübreden başarı değerlendirmek için eksikliği yunus gibi türlerin üreme teknolojileri yavaş gelişmesine katkıda bulunur. Yakın zamana kadar şişe burunlu yunus (Tursiops truncatus) temel seminal parametreler bildirilen1,2vardı değildi. Ancak, hareketliliği ve Morfoloji, gibi değişkenler her ne kadar yaygın olarak kullanılan, üreme verimliliği hakkında sınırlı bilgi verir. En iyi sperm kalitesini Gübreden potansiyeli değerlendirme göstergesidir.
Son zamanlarda, bizim grup erkek pronuclear oluşumu ve/veya melez embriyo oluşumu zona olduğu gibi sığır yumurta3kullanarak kapaklı tüp bebek sonra değerlendirme tarafından potansiyel gübreleme yunus sperm değerlendirmek için kullanılan bir yöntem. Yunus-sığır kapaklı tüp bebek gibi yunus yumurta elde etme zorluk üstesinden homolog IVF, önemli avantajları vardır ve iyi sınanmış vitro sığır oosit olgunlaşma sistemlerinin kullanımı kolaylaştırır. Türler Özgüllük önlemek amacıyla, kapaklı fertilizasyon genellikle ZP olmaması durumunda gerçekleştirilir. Her ne kadar vitelline membran ile sigorta yeteneği acrosome tepki sperm değerlendirilmesi için sağlar, gübreleme için ilgili diğer özelliklerin değerlendirilmesi bozar. Açıklanan yordamı zona sağlam yumurta kullanır ve izni aşağıdaki parametrelerin değerlendirilmesi: sperm zona bağlama ve eki, penetrasyon, polyspermy, pronuclear oluşumu ve Melez embriyo bölünme.
Burada, çeşitli protokoller sperm toplama, temel sperm analizi, sperm dondurma yanı sıra yunus sperm işlevselliği değerlendirilmesi için kapaklı tüp bebek sonra erkek pronuclear ve/veya melez embriyo oluşumu değerlendirmek tarafından zona olduğu gibi kullanarak mevcut sığır yumurtalar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Birçok farklı memeli türü için dondurulmuş çözdürülen sperm kullanılarak çeşitli yararları vardır. Bu değerli genetik materyal, dünya çapında dağıtımı için potansiyel, düşük kirlenme riski ve erkek gamet yıllardır korumak yeteneği aktarma yeteneği içerir. Bu tür ek II, taşıma ve hayvanların farklı su parkları arasında değişimi sınırlayan DEĞİNİR altında korunduğu için cryopreserved sperm kullanımı şişe burunlu yunus için esastır. Yunuslar taşıma, lojistik sorunlar …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
onun iş ekonomi ve rekabet (AGL2015-70140-R ö. Rizos için), AGL2015-66145R A. Gutierrez-Adan ve J. F. Pérez-Gutiérrez ve Seneca Murcia Vakfı (Grant 20040/mikrop/16 F. García-Vázquez için) İspanyolca Bakanlığı tarafından finanse edildi
Materials
| FERT-TALP medium | Merck | |
| TCM-199 | Sigma | M-4530 |
| Hoechst 33342 | Sigma | B-2261 |
| 4-well dishes | Nunc | 176740 |
| Density gradient BoviPure | Nidacon International | BP-100 |
| Washing solution Boviwash | Nidacon International | BW-100 |
| Magnesium chloride | Promega | A35 1H |
| Sterile water | Mili Q sintesis A10 Millipore | A35 1H |
| Buffer Tris Borate EDTA | Sigma | T4415 |
| MB agarose | Biotools | 20.012 |
| 5X GoTaq flexi buffer | Mili Q sintesis A10 Millipore | M 890 A |
| MB agarose | Biotools | 20.012 |
| Taq polymerase | Promega | |
| SafeView | NBS Biologicals Ltd. | M 890 A |
| Makler counting chamber | Sefi Medical | |
| Thoma chamber | Hecht-Assistant | |
| pHmeter MicropH 2000 | Crison Instruments | |
| Osmometer Advanced micro osmometer 3300 | Norwood | |
| Computer assisted sperm analysis system | Projectes y Serveis R+D | |
| Stereomicroscope MZ 95 | Leica | |
| Epifluorescent optics Eclipse Te300 | Nikon | |
| Confocal assistant 4.02 software | Bio-Rad | 3D analysis software |
| Confocal laser scanning microscopy | Bio-Rad | |
| Micropippetes (P2. P20, P200, P1000) | Gilson | |
| Microcentrifuge tubes | VWR | |
| UV iluminator | Bio-Rad | |
| PCR Thermal cycler Primus 96 Plus | MWG AG Biotech |
References
- Montano, G. A., et al. Evaluation of motility, membrane status and DNA integrity of frozen-thawed bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa after sex-sorting and recryopreservation. Reproduction. 143 (6), 799-813 (2012).
- Sánchez-calabuig, M. J., et al. Validation of a field based chromatin dispersion assay to assess sperm DNA fragmentation in the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Reprod Domest Anim. 49 (5), 761-768 (2014).
- Sánchez-calabuig, M. J., et al. Heterologous murine and bovine IVF using bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa. Theriogenology. 84 (6), 983-994 (2015).
- Keller, K. V. Training of the Atlantic bottlenose dolphins (Tursiops truncatus) for artificial insemination. IAAAM. 14 (22), 22-24 (1986).
- Robeck, T. R., O’brien, J. K. Effect of cryopreservation methods and precryopreservation storage on bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa. Biol Reprod. 70 (5), 1340-1348 (2004).
- Coy, P., et al. Hardening of the zona pellucida of unfertilized eggs can reduce polyspermic fertilization in the pig and cow. Reproduction. 135 (1), 19-27 (2008).
- Seager, S., W, G., Moore, L., Platz, C., Kirby, V. Semen collection (electroejaculation), evaluation and freezing in the Atlantic bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Proceedings of the American Association of Zoo Veterinarians. 136, (1981).
- Schroeder, J. P., Leatherwood, S., Reeves, R. R. Breeding Bottlenose Dolphins in captivity. The Bottlenose dolphin. , 447-460 (1990).
- Sánchez-Calabuig, M. J., et al. Effect of cryopreservation on the sperm DNA fragmentation dynamics of the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Reprod Domest Anim. 50 (2), 227-235 (2015).
- Robeck, T. R., et al. Estrous cycle characterisation and artificial insemination using frozen-thawed spermatozoa in the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Reproduction. 129 (5), 659-674 (2005).
- Robeck, T. R., et al. Development and evaluation of deep intra-uterine artificial insemination using cryopreserved sexed spermatozoa in bottlenose dolphins (Tursiops truncatus). Anim Reprod Sci. 139 (1-4), 168-181 (2013).
- Schroeder, J. P., Leatherwood, S., Reeves, R. R. Breeding Bottlenose Dolphins in captivity. The Bottlenose dolphin. , 447-460 (1990).
- Madeddu, M., et al. Effect of cooling rate on the survival of cryopreserved rooster sperm: Comparison of different distances in the vapor above the surface of the liquid nitrogen. Anim Reprod Sci. , (2016).
