병 코 돌고래 (Tursiops truncatus) 정 충: Cryopreservation, 수집과 Heterologous 체 외에서 수정
Summary
여기, 우리는 돌고래 정 충, cryopreservation, 수집과 소 oocytes를 사용 하 여 분리 IVF 성능을 위해 성공적으로 사용 된 프로토콜을 제시.
Abstract
Cryopreserved 돌핀 정 충의 사용 수 중 공원 사이 유전 물질의 교환을 용이 하 게 하 고 정 충은 해양 포유 동물 복제에 대 한 우리의 이해를 심화 하기 위해 연구 실험실에 액세스할 수 있습니다. 분리 IVF, 동종 IVF에 대 한 대체 잠재적인; 정자 비 옥을 테스트 하는 수단을 제공할 수 있습니다. 연구 생식 체 생리학 및 초기 배아 발달; 그리고 얻기 어려운 귀중 한 돌고래 oocytes의 사용을 피하기 위해. 여기, 우리는 성공적으로 수집 하 고 돌고래 정 충 cryopreserve 사용 된 프로토콜을 제시. 정액의 컬렉션은 훈련 된 돌고래에 수동 자극에 의해 수행 됩니다. Cryopreservation은 글리세롤과 트리 스 달걀 노른자위 기반 extender를 사용 하 여 수행 됩니다. 또한, 우리는 분리 IVF 돌고래 정 충와 소 oocytes를 사용 하 여 설명 하 고는 PCR를 사용 하 여 결과 배아의 하이브리드 성격을 확인 하는 프로토콜을 제시. 분리 수정 수정에 대 한 질문을 제기 하 고 생식 체 생리학과 초기 배아 발달을 공부 하는 도구로 사용 될 수 있습니다. 또한, 분리 IVF의 성공 테스트 돌고래 정자 비 옥 하 게 용량을 추가 검사의 가치가이 기술의 잠재력을 보여 줍니다.
Introduction
보조 생식 기술 해양 포유류를 포함 하 여 야생 동물에 가난 하 게 개발 된다. 정자 기름 성공 평가에 중요 한 방법의 부족 느린 돌고래 종에서 생식 기술 개발에 기여 한다. 그것은 아니었다 최근까지 bottlenose 돌고래 (Tursiops truncatus)의 기본 정액 매개 변수 보고1,2했다. 그러나, 운동 성 및 형태학, 같은 변수 널리 사용 되 고 있지만 생식 효율성에 제한 된 정보 제공. 정자 품질 최고의 지표는 기름 잠재력의 평가.
최근, 우리의 그룹 돌고래 정자 남성 pronuclear 형성 및 zona 그대로 소 oocytes3를 사용 하 여 분리 IVF 후 하이브리드 배아 형성 평가 하 여 잠재적인 비 옥 평가 메서드를 사용 합니다. 돌고래 소 분리 IVF 사용 하 여 중요 한 이점이 동종 IVF, 돌고래 oocytes를 얻기의 어려움 극복으로 있으며 소 oocyte 성숙 시스템 잘 테스트 체 외에서 사용을 용이 하 게. 종 특이성을 피하려면 분리 수정 ZP의 부재에서 일반적으로 수행 됩니다. Vitelline 막으로 융합 acrosome 반응 정 충의 능력의 평가 대 한 수 있습니다, 하지만 그것은 수정에 관련 된 다른 기능 평가 손상 한다. 설명 하는 절차 zona 그대로 oocytes를 사용 하 고 다음 매개 변수 평가: 정자 zona 바인딩 및 첨부 파일, 침투, polyspermy, pronuclear 형성 및 하이브리드 배아 분열.
여기, 우리가 현재 정자 컬렉션, 기본 정자 분석, 정 충 동결 뿐만 아니라 돌고래 정자 기능 평가 대 한 여러 가지 프로토콜 heterologous 체 외 수정 후 남성 pronuclear 및 하이브리드 배아 형성 평가 하 여 zona 그대로 사용 하 여 소 oocytes입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
많은 다른 포유류 종에 대 한 동결-해 동 정자를 사용 하 여 다양 한 장점이 있다. 이 귀중 한 유전 물질, 전세계 유통에 대 한 가능성, 오염, 낮은 위험 그리고 수십 년 동안 남성 gametes를 보존 하는 기능을 전송 하는 기능을 포함 합니다. Cryopreserved의 사용이이 종 부록 II의 인용, 전송 및 다른 수 중 공원 사이 동물의 교류를 제한 하는 보호 때문에 bottlenose 돌고래에 대 한 필수적입니다. 돌고래 수송 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
그의 작품은 경제와 경쟁력 (AGL2015-70140-R은 D. Rizos), AGL2015-66145R A. 구 티에 레즈-아덴 및 J. F. 페 레 스-구 티에 레즈와 세네카 재단의 무르시아 (그랜트 20040/세균/16 F. 가르시아 바스 케 스에 게) 스페인 정부에 의해 투자 되었다
Materials
| FERT-TALP medium | Merck | |
| TCM-199 | Sigma | M-4530 |
| Hoechst 33342 | Sigma | B-2261 |
| 4-well dishes | Nunc | 176740 |
| Density gradient BoviPure | Nidacon International | BP-100 |
| Washing solution Boviwash | Nidacon International | BW-100 |
| Magnesium chloride | Promega | A35 1H |
| Sterile water | Mili Q sintesis A10 Millipore | A35 1H |
| Buffer Tris Borate EDTA | Sigma | T4415 |
| MB agarose | Biotools | 20.012 |
| 5X GoTaq flexi buffer | Mili Q sintesis A10 Millipore | M 890 A |
| MB agarose | Biotools | 20.012 |
| Taq polymerase | Promega | |
| SafeView | NBS Biologicals Ltd. | M 890 A |
| Makler counting chamber | Sefi Medical | |
| Thoma chamber | Hecht-Assistant | |
| pHmeter MicropH 2000 | Crison Instruments | |
| Osmometer Advanced micro osmometer 3300 | Norwood | |
| Computer assisted sperm analysis system | Projectes y Serveis R+D | |
| Stereomicroscope MZ 95 | Leica | |
| Epifluorescent optics Eclipse Te300 | Nikon | |
| Confocal assistant 4.02 software | Bio-Rad | 3D analysis software |
| Confocal laser scanning microscopy | Bio-Rad | |
| Micropippetes (P2. P20, P200, P1000) | Gilson | |
| Microcentrifuge tubes | VWR | |
| UV iluminator | Bio-Rad | |
| PCR Thermal cycler Primus 96 Plus | MWG AG Biotech |
References
- Montano, G. A., et al. Evaluation of motility, membrane status and DNA integrity of frozen-thawed bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa after sex-sorting and recryopreservation. Reproduction. 143 (6), 799-813 (2012).
- Sánchez-calabuig, M. J., et al. Validation of a field based chromatin dispersion assay to assess sperm DNA fragmentation in the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Reprod Domest Anim. 49 (5), 761-768 (2014).
- Sánchez-calabuig, M. J., et al. Heterologous murine and bovine IVF using bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa. Theriogenology. 84 (6), 983-994 (2015).
- Keller, K. V. Training of the Atlantic bottlenose dolphins (Tursiops truncatus) for artificial insemination. IAAAM. 14 (22), 22-24 (1986).
- Robeck, T. R., O’brien, J. K. Effect of cryopreservation methods and precryopreservation storage on bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa. Biol Reprod. 70 (5), 1340-1348 (2004).
- Coy, P., et al. Hardening of the zona pellucida of unfertilized eggs can reduce polyspermic fertilization in the pig and cow. Reproduction. 135 (1), 19-27 (2008).
- Seager, S., W, G., Moore, L., Platz, C., Kirby, V. Semen collection (electroejaculation), evaluation and freezing in the Atlantic bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Proceedings of the American Association of Zoo Veterinarians. 136, (1981).
- Schroeder, J. P., Leatherwood, S., Reeves, R. R. Breeding Bottlenose Dolphins in captivity. The Bottlenose dolphin. , 447-460 (1990).
- Sánchez-Calabuig, M. J., et al. Effect of cryopreservation on the sperm DNA fragmentation dynamics of the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Reprod Domest Anim. 50 (2), 227-235 (2015).
- Robeck, T. R., et al. Estrous cycle characterisation and artificial insemination using frozen-thawed spermatozoa in the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Reproduction. 129 (5), 659-674 (2005).
- Robeck, T. R., et al. Development and evaluation of deep intra-uterine artificial insemination using cryopreserved sexed spermatozoa in bottlenose dolphins (Tursiops truncatus). Anim Reprod Sci. 139 (1-4), 168-181 (2013).
- Schroeder, J. P., Leatherwood, S., Reeves, R. R. Breeding Bottlenose Dolphins in captivity. The Bottlenose dolphin. , 447-460 (1990).
- Madeddu, M., et al. Effect of cooling rate on the survival of cryopreserved rooster sperm: Comparison of different distances in the vapor above the surface of the liquid nitrogen. Anim Reprod Sci. , (2016).
