बॉटलनोज़ डॉल्फिन (Tursiops truncatus) शुक्राणु: Collection, Cryopreservation, और Heterologous इन विट्रो निषेचन
Summary
यहां, हम प्रोटोकॉल है कि सफलतापूर्वक डॉल्फिन शुक्राणु संग्रह, cryopreservation, और heterologous आईवीएफ गोजातीय अंडाणुओं का उपयोग कर प्रदर्शन के लिए इस्तेमाल किया गया है उपस्थित ।
Abstract
cryopreserved डॉल्फिन शुक्राणु के उपयोग जलीय पार्क के बीच आनुवंशिक सामग्री के आदान प्रदान की सुविधा और अध्ययन के लिए प्रयोगशालाओं के लिए सुलभ शुक्राणु बनाता है समुद्री स्तनधारी प्रजनन की हमारी समझ को आगे । Heterologous आईवीएफ, मुताबिक़ आईवीएफ के लिए एक प्रतिस्थापन, एक शुक्राणु प्रजनन क्षमता का परीक्षण करने के लिए साधन प्रदान कर सकता है; gamete फिजियोलॉजी और शीघ्र भ्रूण विकास का अध्ययन करने के लिए; और मूल्यवान डॉल्फिन अंडाणुओं, जो प्राप्त करने के लिए मुश्किल है के उपयोग से बचने के लिए । यहां, हम वर्तमान प्रोटोकॉल है कि सफलतापूर्वक इकट्ठा करने के लिए इस्तेमाल किया गया है और cryopreserve डॉल्फिन शुक्राणु । वीर्य का संग्रह प्रशिक्षित डॉल्फिन पर मैनुअल उत्तेजना द्वारा किया जाता है । Cryopreservation एक TRIS egg-ग्लिसरॉल के साथ जर्दी आधारित भरनेवाला का उपयोग कर पूरा किया है । इसके अलावा, हम एक प्रोटोकॉल है कि heterologous आईवीएफ डॉल्फिन शुक्राणु और गोजातीय अंडाणुओं का उपयोग का वर्णन करता है और जो पीसीआर का उपयोग करने के परिणामस्वरूप भ्रूण की संकर प्रकृति की पुष्टि पेश करते हैं । Heterologous निषेचन निषेचन पर सवाल उठाती है और एक उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है gamete फिजियोलॉजी और जल्दी भ्रूण विकास का अध्ययन । इसके अलावा, heterologous आईवीएफ की सफलता के लिए इस तकनीक की क्षमता को प्रदर्शित करता है डॉल्फिन शुक्राणु खाद, जो आगे की परीक्षा के लायक है निषेचित परीक्षण ।
Introduction
सहायता प्राप्त प्रजनन प्रौद्योगिकियों खराब जंगली जानवरों में विकसित कर रहे हैं, समुद्री स्तनधारी सहित । संवेदनशील तरीकों का अभाव शुक्राणु निषेचन सफलता का आकलन करने के लिए ऐसी डॉल्फिन के रूप में प्रजातियों में प्रजनन प्रौद्योगिकियों के धीमी गति से विकास में योगदान देता है । यह हाल ही में जब तक कि बॉटलनोज़ डॉल्फिन (Tursiops truncatus) के बुनियादी लाभदायक मापदंडों1,2की सूचना दी गई थी । हालांकि, गतिशीलता और आकृति विज्ञान जैसे चर, हालांकि व्यापक रूप से इस्तेमाल किया, प्रजनन क्षमता पर सीमित जानकारी देते हैं । शुक्राणु की गुणवत्ता का सबसे अच्छा संकेतक निषेचन क्षमता का मूल्यांकन है ।
हाल ही में, हमारे समूह के लिए एक विधि इस्तेमाल किया डॉल्फिन शुक्राणु का आकलन करने के लिए पुरुष परमाणु गठन और/या संकर भ्रूण के गठन का आकलन द्वारा क्षमता निषेचन heterologous आईवीएफ zona बरकरार गोजातीय अंडाणुओं का उपयोग कर के बाद3। डॉल्फिन का उपयोग-गोजातीय heterologous आईवीएफ मुताबिक़ आईवीएफ पर महत्वपूर्ण लाभ है, के रूप में यह डॉल्फिन अंडाणुओं प्राप्त करने की कठिनाई पर काबू पाने और अच्छी तरह से परीक्षण के उपयोग की सुविधा इन विट्रो गोजातीय oocyte परिपक्वता प्रणालियों । आदेश में प्रजातियों विशिष्टता से बचने के लिए, heterologous निषेचन आम तौर पर जिला के अभाव में किया जाता है । हालांकि यह acrosome की क्षमता के मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है-प्रतिक्रिया शुक्राणु vitelline झिल्ली के साथ फ्यूज, यह अंय निषेचन से संबंधित सुविधाओं के मूल्यांकन बिगड़ जाती है । प्रक्रिया zona बरकरार अंडाणुओं का उपयोग करता है और निंनलिखित मापदंडों के मूल्यांकन की अनुमति देता है: शुक्राणु zona बंधन और लगाव, पैठ, polyspermy, परमाणु गठन, और संकर भ्रूण दरार ।
यहां, हम शुक्राणु संग्रह के लिए कई प्रोटोकॉल मौजूद, बुनियादी शुक्राणु विश्लेषण, शुक्राणु ठंड के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पुरुष परमाणु और/या संकर भ्रूण गठन का आकलन द्वारा डॉल्फिन शुक्राणु कार्यशीलता के मूल्यांकन के बाद heterologous आईवीएफ का उपयोग zona बरकरार गोजातीय अंडाणुओं.
Protocol
आचार कथन: सभी प्रायोगिक प्रक्रियाओं की समीक्षा की गई और संस्थागत पशु परिचर्या एवं उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित Instituto Nacional de Investigaci & #243; n y Tecnolog & #237; अ Agraria y Alimentaria (िनिा). सभी प्रयोगों की देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं के ?…
Representative Results
Discussion
कई अलग स्तनधारी प्रजातियों के लिए, जमे हुए गल शुक्राणु का उपयोग करने के लिए विविध लाभ कर रहे हैं । इनमें मूल्यवान आनुवंशिक सामग्री, विश्वव्यापी वितरण के लिए संभावित, संदूषण के कम जोखिम, और दशकों के लिए प?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
उनके काम स्पेनी अर्थव्यवस्था और प्रतिस्पर्धा के मंत्रालय द्वारा वित्त पोषित किया गया (AGL2015-70140-आर डी के लिए । Rizos, AGL2015-66145R को अ. एबल-अडाण और जे. एफ. Pérez-gutierrez) और Seneca फाउंडेशन ऑफ मर्सिया (अनुदान 20040/रोगाणु/16 to f. García-vazquez)
Materials
| FERT-TALP medium | Merck | |
| TCM-199 | Sigma | M-4530 |
| Hoechst 33342 | Sigma | B-2261 |
| 4-well dishes | Nunc | 176740 |
| Density gradient BoviPure | Nidacon International | BP-100 |
| Washing solution Boviwash | Nidacon International | BW-100 |
| Magnesium chloride | Promega | A35 1H |
| Sterile water | Mili Q sintesis A10 Millipore | A35 1H |
| Buffer Tris Borate EDTA | Sigma | T4415 |
| MB agarose | Biotools | 20.012 |
| 5X GoTaq flexi buffer | Mili Q sintesis A10 Millipore | M 890 A |
| MB agarose | Biotools | 20.012 |
| Taq polymerase | Promega | |
| SafeView | NBS Biologicals Ltd. | M 890 A |
| Makler counting chamber | Sefi Medical | |
| Thoma chamber | Hecht-Assistant | |
| pHmeter MicropH 2000 | Crison Instruments | |
| Osmometer Advanced micro osmometer 3300 | Norwood | |
| Computer assisted sperm analysis system | Projectes y Serveis R+D | |
| Stereomicroscope MZ 95 | Leica | |
| Epifluorescent optics Eclipse Te300 | Nikon | |
| Confocal assistant 4.02 software | Bio-Rad | 3D analysis software |
| Confocal laser scanning microscopy | Bio-Rad | |
| Micropippetes (P2. P20, P200, P1000) | Gilson | |
| Microcentrifuge tubes | VWR | |
| UV iluminator | Bio-Rad | |
| PCR Thermal cycler Primus 96 Plus | MWG AG Biotech |
References
- Montano, G. A., et al. Evaluation of motility, membrane status and DNA integrity of frozen-thawed bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa after sex-sorting and recryopreservation. Reproduction. 143 (6), 799-813 (2012).
- Sánchez-calabuig, M. J., et al. Validation of a field based chromatin dispersion assay to assess sperm DNA fragmentation in the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Reprod Domest Anim. 49 (5), 761-768 (2014).
- Sánchez-calabuig, M. J., et al. Heterologous murine and bovine IVF using bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa. Theriogenology. 84 (6), 983-994 (2015).
- Keller, K. V. Training of the Atlantic bottlenose dolphins (Tursiops truncatus) for artificial insemination. IAAAM. 14 (22), 22-24 (1986).
- Robeck, T. R., O’brien, J. K. Effect of cryopreservation methods and precryopreservation storage on bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa. Biol Reprod. 70 (5), 1340-1348 (2004).
- Coy, P., et al. Hardening of the zona pellucida of unfertilized eggs can reduce polyspermic fertilization in the pig and cow. Reproduction. 135 (1), 19-27 (2008).
- Seager, S., W, G., Moore, L., Platz, C., Kirby, V. Semen collection (electroejaculation), evaluation and freezing in the Atlantic bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Proceedings of the American Association of Zoo Veterinarians. 136, (1981).
- Schroeder, J. P., Leatherwood, S., Reeves, R. R. Breeding Bottlenose Dolphins in captivity. The Bottlenose dolphin. , 447-460 (1990).
- Sánchez-Calabuig, M. J., et al. Effect of cryopreservation on the sperm DNA fragmentation dynamics of the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Reprod Domest Anim. 50 (2), 227-235 (2015).
- Robeck, T. R., et al. Estrous cycle characterisation and artificial insemination using frozen-thawed spermatozoa in the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Reproduction. 129 (5), 659-674 (2005).
- Robeck, T. R., et al. Development and evaluation of deep intra-uterine artificial insemination using cryopreserved sexed spermatozoa in bottlenose dolphins (Tursiops truncatus). Anim Reprod Sci. 139 (1-4), 168-181 (2013).
- Schroeder, J. P., Leatherwood, S., Reeves, R. R. Breeding Bottlenose Dolphins in captivity. The Bottlenose dolphin. , 447-460 (1990).
- Madeddu, M., et al. Effect of cooling rate on the survival of cryopreserved rooster sperm: Comparison of different distances in the vapor above the surface of the liquid nitrogen. Anim Reprod Sci. , (2016).
