Bottlenose Dolphin (Tursiops truncatus) spermier: insamling, frysförvaring och heterologa In Vitro fertilisering
Summary
Här presenterar vi protokoll som framgångsrikt har använts för dolphin spermier insamling, frysförvaring och heterologa IVF prestanda med nötkreatur oocyter.
Abstract
Användning av frysförvarade dolphin spermier underlättar utbyte av genetiskt material mellan vattenparker och gör spermier tillgänglig för laboratorier för studier för att ytterligare vår förståelse av marina däggdjur reproduktion. Heterologa IVF, en ersättning för homologa IVF, kan vara ett medel att testa spermier fertilitet potentiella; att studera gamet fysiologi och tidig embryo utveckling. och för att undvika användning av värdefull dolphin oocyter, som är svårt att få. Här presenterar vi protokoll som framgångsrikt har använts för att samla och frysa dolphin spermier. Insamling av sperma utförs genom manuell stimulering på utbildade delfiner. Frysförvaring sker med hjälp av en TRIS äggula-baserat extender med glycerol. Dessutom presenterar vi ett protokoll som beskriver heterologa IVF med dolphin spermier och bovin oocyter och som verifierar hybridkaraktär resulterande embryot med PCR. Heterologa befruktning väcker frågor om gödsling och kan användas som ett verktyg för att studera gamet fysiologi och tidiga embryoutvecklingen. Dessutom visar heterologa IVF framgång potentialen för denna teknik för att testa dolphin spermier gödsling kapacitet, vilket är värt ytterligare granskning.
Introduction
Assisterad befruktning är dåligt utvecklade i vilda djur, inklusive marina däggdjur. Avsaknaden av känsliga metoder för att bedöma spermier gödsla framgång bidrar till den långsamma utvecklingen av reproduktiva tekniker i arter som delfiner. Det var inte förrän nyligen att nyskapande grundparametrarna för flasknosdelfinen (Tursiops truncatus) var rapporterade1,2. Men ger variabler såsom motilitet och morfologi, även om ofta används, begränsad information om reproduktiv effektivitet. Den bästa indikatorn på spermiernas kvalitet är utvärderingen av gödning potential.
Nyligen har använde vår grupp en metod för att bedöma dolphin spermier gödsling potential genom att bedöma manliga pronukleär bildning och/eller hybrid embryo bildas efter heterologa IVF med zona intakt nötkreatur oocyter3. Användning av dolphin-nötkreatur heterologa IVF har viktiga fördelar över homologa IVF, som övervinner den svårigheten att få dolphin oocyter och underlättar användningen av väl beprövad i vitro nötkreatur oocyt mognad system. För att undvika arter specificitet, utförs generellt heterologa befruktning i avsaknad av ZP. Även om det låter för utvärdering av de akrosomen-reagerade spermier förmåga att smälta samman med det vitelline membranet, försämrar det utvärderingen av andra funktioner relaterade till befruktning. Proceduren använder zona intakt oocyter och medger utvärdering av följande parametrar: spermier zona bindande och fastsättning, penetration, polyspermy, pronukleär bildning och hybrid embryo klyvning.
Här presenterar vi flera protokoll för spermier samling, grundläggande spermier analys, spermier frysning samt utvärdering av dolphin spermier funktionaliteten genom att bedöma manliga pronukleär eller hybrid embryo bildas efter heterologa IVF med zona intakt bovin oocyter.
Protocol
Representative Results
Discussion
För många olika däggdjursarter finns det olika fördelar med att använda frysta-tinade spermier. Dessa inkluderar möjligheten att överföra värdefullt genetiskt material, potential för global distribution, den låga risken för kontaminering och förmågan att bevara manliga könsceller i årtionden. Användning av frysförvarade spermier är viktigt för flasknosdelfinen, eftersom denna art är skyddad under Appendix II i CITES, vilket begränsar transport och utbyte av djur mellan olika vattenparker. Delfiner ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
hans arbete finansierades av det spanska ministeriet för ekonomi och konkurrenskraft (AGL2015-70140-R till D. Rizos), AGL2015-66145R A. Gutierrez-Adan och J. F. Pérez-Gutiérrez och Seneca Foundation i Murcia (Grant 20040/GRODDAR/16 till F. García-Vázquez)
Materials
| FERT-TALP medium | Merck | |
| TCM-199 | Sigma | M-4530 |
| Hoechst 33342 | Sigma | B-2261 |
| 4-well dishes | Nunc | 176740 |
| Density gradient BoviPure | Nidacon International | BP-100 |
| Washing solution Boviwash | Nidacon International | BW-100 |
| Magnesium chloride | Promega | A35 1H |
| Sterile water | Mili Q sintesis A10 Millipore | A35 1H |
| Buffer Tris Borate EDTA | Sigma | T4415 |
| MB agarose | Biotools | 20.012 |
| 5X GoTaq flexi buffer | Mili Q sintesis A10 Millipore | M 890 A |
| MB agarose | Biotools | 20.012 |
| Taq polymerase | Promega | |
| SafeView | NBS Biologicals Ltd. | M 890 A |
| Makler counting chamber | Sefi Medical | |
| Thoma chamber | Hecht-Assistant | |
| pHmeter MicropH 2000 | Crison Instruments | |
| Osmometer Advanced micro osmometer 3300 | Norwood | |
| Computer assisted sperm analysis system | Projectes y Serveis R+D | |
| Stereomicroscope MZ 95 | Leica | |
| Epifluorescent optics Eclipse Te300 | Nikon | |
| Confocal assistant 4.02 software | Bio-Rad | 3D analysis software |
| Confocal laser scanning microscopy | Bio-Rad | |
| Micropippetes (P2. P20, P200, P1000) | Gilson | |
| Microcentrifuge tubes | VWR | |
| UV iluminator | Bio-Rad | |
| PCR Thermal cycler Primus 96 Plus | MWG AG Biotech |
References
- Montano, G. A., et al. Evaluation of motility, membrane status and DNA integrity of frozen-thawed bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa after sex-sorting and recryopreservation. Reproduction. 143 (6), 799-813 (2012).
- Sánchez-calabuig, M. J., et al. Validation of a field based chromatin dispersion assay to assess sperm DNA fragmentation in the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Reprod Domest Anim. 49 (5), 761-768 (2014).
- Sánchez-calabuig, M. J., et al. Heterologous murine and bovine IVF using bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa. Theriogenology. 84 (6), 983-994 (2015).
- Keller, K. V. Training of the Atlantic bottlenose dolphins (Tursiops truncatus) for artificial insemination. IAAAM. 14 (22), 22-24 (1986).
- Robeck, T. R., O’brien, J. K. Effect of cryopreservation methods and precryopreservation storage on bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa. Biol Reprod. 70 (5), 1340-1348 (2004).
- Coy, P., et al. Hardening of the zona pellucida of unfertilized eggs can reduce polyspermic fertilization in the pig and cow. Reproduction. 135 (1), 19-27 (2008).
- Seager, S., W, G., Moore, L., Platz, C., Kirby, V. Semen collection (electroejaculation), evaluation and freezing in the Atlantic bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Proceedings of the American Association of Zoo Veterinarians. 136, (1981).
- Schroeder, J. P., Leatherwood, S., Reeves, R. R. Breeding Bottlenose Dolphins in captivity. The Bottlenose dolphin. , 447-460 (1990).
- Sánchez-Calabuig, M. J., et al. Effect of cryopreservation on the sperm DNA fragmentation dynamics of the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Reprod Domest Anim. 50 (2), 227-235 (2015).
- Robeck, T. R., et al. Estrous cycle characterisation and artificial insemination using frozen-thawed spermatozoa in the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Reproduction. 129 (5), 659-674 (2005).
- Robeck, T. R., et al. Development and evaluation of deep intra-uterine artificial insemination using cryopreserved sexed spermatozoa in bottlenose dolphins (Tursiops truncatus). Anim Reprod Sci. 139 (1-4), 168-181 (2013).
- Schroeder, J. P., Leatherwood, S., Reeves, R. R. Breeding Bottlenose Dolphins in captivity. The Bottlenose dolphin. , 447-460 (1990).
- Madeddu, M., et al. Effect of cooling rate on the survival of cryopreserved rooster sperm: Comparison of different distances in the vapor above the surface of the liquid nitrogen. Anim Reprod Sci. , (2016).
