Methoden om te studeren epitheliale Transport Protein functie en de expressie in Inheemse darm en Caco-2-cellen gekweekt in 3D
Summary
We beschrijven eenvoudige methoden de regulering van intestinale serotonine transporter (SERT) functie en expressie onder toepassing van een in vitro celkweek model van Caco-2-cellen gekweekt in 3D en een ex vivo model van muis darmen bestuderen. Deze methoden zijn geschikt voor de studie van andere epitheliale transporters.
Abstract
Het darmepitheel heeft belangrijke transport en barrière functies die een belangrijke rol spelen in de normale fysiologische functies van het lichaam, terwijl het verstrekken van een barrière voor vreemde deeltjes. Verminderde epitheliale transport (ionen, nutriënten of drugs) is geassocieerd met vele ziekten en kan gevolgen die verder gaan dan de normale fysiologische functies van de transporteurs, zoals door beïnvloeding van epitheliale integriteit en de darmen microbiome hebben. Inzicht in de functie en regulatie van transporteiwitten is cruciaal voor de ontwikkeling van verbeterde therapeutische interventies. De grootste uitdaging in de studie van epitheliale transport ontwikkelt een geschikt modelsysteem dat belangrijke kenmerken van de natieve darmepitheelcellen recapituleert. Verscheidene in vitro celkweekmodellen, zoals Caco-2, T-84, en HT-29-cellen Cl.19A worden doorgaans gebruikt in epitheliale vervoersonderzoek. Deze cellijnen zijn een reductionistische benadering van het modelleren van de epithelium en zijn gebruikt in tal van mechanistische studies, met inbegrip van hun onderzoek van epitheliale-microbiële interacties. Echter, celmonolagen geen nauwkeurige weergave van cel-cel interacties en in vivo micro-omgeving. Cellen gekweekt in 3D blijkt veelbelovend modellen permeabiliteit studies. We laten zien dat Caco-2-cellen in 3D kan worden gebruikt voor epitheliale transporters bestuderen. Het is ook belangrijk dat studies in Caco-2-cellen worden aangevuld met andere modellen uitsluiten celspecifieke effecten en rekening houdend met de complexiteit van de natieve darm. Verscheidene werkwijzen zijn eerder gebruikt om de functionaliteit van transporteurs, zoals eversie sac en opname in geïsoleerde epitheelcellen of geïsoleerde plasmamembraan vesikels beoordelen. Rekening houdend met de uitdagingen op ten opzichte van modellen en het meten van transportfunctie, tonen we hier een protocol voor Caco-2 cellen groeien in 3D en beschrijven het gebruik van een Ussing kamer alseffectieve aanpak serotonine transport, zoals in intacte gepolariseerde intestinale epitheel te meten.
Introduction
Het darmepitheel is voorzien van diverse transporteiwitten (kanalen, ATPasen, co-transporters en wisselaars) dat talrijke functies variërend van de opname van voedingsstoffen, elektrolyten voeren, en middelen om de uitscheiding van vocht en ionen in het lumen. Transporteiwitten genereren elektrochemische gradiënt die de beweging van ionen of moleculen toestaan in een vectoriële wijze. Dit wordt bereikt door de asymmetrische verdelingen van de transportsystemen van de apicale en basolaterale membranen van gepolariseerde epitheliale cellen. Bovendien tight junctions die tegen epitheelcellen tether, spelen een belangrijke rol in dit proces door als een barrière voor het intramembraan diffusie van componenten tussen de apicale en basolaterale membraan domeinen. Geschikte modelsystemen bootsen deze kenmerken van de natieve darm (bijvoorbeeld polariteit, differentiatie en tight junction integriteit) zijn essentieel voor de studie van de functionaliteit van epitheliale transportsystemen.
Met betrekking tot de modellen, de typische cellijnen die momenteel worden gebruikt in intestinale epitheliale transport onderzoek zijn Caco-2, een model van volledig gedifferentieerde, absorberend dunne darm epitheelcellen; en T84 cellen of HT-29 subklonen, modellen of-crypt afgeleide grote darmepitheelcellen 1. Gewoonlijk worden deze cellijnen gekweekt als monolagen in kunststofoppervlakken of beklede Transwell inzetstukken. Trans-well celcultuur inserts enigszins lijken op de in vivo omgeving doordat gepolariseerde cellen basolateraal voeden. Echter een beperking in conventionele 2D kweeksystemen is dat de cellen moeten aanpassen aan een kunstmatige, vlak en stijf oppervlak. Aldus wordt de fysiologische complexiteit van de natieve epitheel niet correct in een 2D systeem. Deze beperking overwonnen door werkwijzen om cellen groeien in 3D in een bepaald micro-omgeving, zoals gelatineuze eiwit Mixture, met een verscheidenheid van extracellulaire matrixcomponenten 2, 3. Niettemin kan het in vitro kweken van de complexiteit van het darmepitheel, die meerdere celtypes en regiospecifieke architectuur in de darm niet simuleren. Zo, de studies met behulp van celkweek modellen vereisen verdere validering in de moedertaal darm. Met behulp van de in vitro 3D celcultuur en muis darmslijmvlies, beschrijven we hier eenvoudige methoden om de regulatie van de intestinale serotonine transporter (SLC6A4, SERT) te bestuderen.
De SERT transporteur regelt de extracellulaire beschikbaarheid van een belangrijke hormoon en neurotransmitter 5-hydroxytryptamine (5-HT) door het snel transporteren door een Na + / Cl – afhankelijke proces. SERT is een bekend doelwit van antidepressiva en recentelijk naar voren gekomen als een nieuw therapeutisch doelwit van maag-darmaandoeningen, zoals diarree en darmontsteking.Werkwijzen onderzoeken 5-HT opname in intestinale epitheliale cellen zijn eerder beschreven. Bijvoorbeeld zijn Caco-2-cellen gekweekt op plastic dragers of doorlatende inzetstukken aangetoond dat fluoxetine-gevoelige 3H-5-HT opname vertonen zowel apicale en basolaterale domeinen 4. De meting van SERT functie in geïsoleerde Brush membraanblaasjes (BBMVs) bereid uit menselijk orgaan donor dunne darm is ook beschreven door 5 ons. 3H-5-HT opname in humane BBVMs bleek fluoxetine-gevoelige en Na + / Cl zijn – afhankelijke en vertoonde verzadigingskinetiek met een Km van 300 nM 5. Met behulp van vergelijkbare methoden, hebben we ook eerder gemeten SERT functie als 3H-5-HT opname in de muis intestinale BBMVs 6. De bereiding van zuivere plasmamembraan vesikels vereist een grote hoeveelheid weefsel mucosa. Andere methoden, zoals radiographic visualisatie van 3H-5-HT opname plaatsen, ook eerder aangetoond in cavia en rat dunne darm 7.
De Ussingkamer een meer fysiologisch systeem voor het transport van ionen, nutriënten en geneesmiddelen in verschillende epitheliale weefsels te meten. Het belangrijkste voordeel van de Ussingkamer techniek is dat daardoor de nauwkeurige meting van de elektrische en transportparameters van intacte, gepolariseerde darmepitheel. Verder de invloed van de intrinsieke neuromusculaire systeem te minimaliseren, kan seromuscular strippen van intestinale mucosa worden uitgevoerd om de regulering van transporters onderzoeken het epitheel 8.
We laten zien dat Caco-2-cellen gekweekt in 3D op gelatineachtige eiwitten vormen een hol lumen expressie afzonderlijke apicale en basolaterale markers. Deze cellen vertonen hogere expressie van SERT dan 2D Caco-2 cellen. Werkwijzen groeien 3D cellen en perform immunokleuring of RNA en eiwit extractie beschreven. Daarnaast beschrijven we methoden om SERT functie en regulatie bestuderen door TGF-β1, een pleiotrope cytokine, in kleine darmmucosa door toepassing van een Ussingkamer techniek.
Protocol
Representative Results
Discussion
Volledig gedifferentieerde Caco-2-celmonolagen werden uitgebreid gebruikt als gepolariseerde epitheliale monolagen intestinale transport 10, 11, 12, 13, 14, 15 bestuderen. Echter, de fysiologische organisatie van darmepitheelcellen na te bootsen, is er aanzienlijke belangstelling voor de ontwikkeling van een Caco-2 cultuur i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Mr. Christopher Manzella, MD/PhD student in the RKG laboratory, for helping to edit and proofread our manuscript.
Materials
| 10X PBS | ATCC | ATCC® HTB37™ | Cells |
| 10X PBS | Carl Zeiss | Microsope for confocal Imaging | |
| 3[H]-5-HT | LabtekII | 152453 | Culturing cells for microscopy |
| 5-HT | Gibco | 70013-032 | Not a hazardous substance |
| 95%O2- 5%Co2 cylinder | KPL | 71-00-27 | Not a hazardous substance |
| Agar (for Agar plates) | Fischer | BP151-100 | Acute toxicity, Ora |
| Agar (for electrode) | Sigma | G7126-1KG | Not a hazardous substance |
| Alexa FluorPhalloidin | Sigma | C3867-1VL | Not a hazardous substance |
| BSA | Sigma | P6148-500G | Harmful if swallowed or if inhaled |
| CaCl2 | LifeTechnologies | A12380 | Not a hazardous substance |
| CaCo2 Cells | Sigma | A8806-5G | Not a hazardous substance |
| Cell lysis Buffer | Fischer | BP337-100 | Not a hazardous substance |
| Chabered slides | Sigma | S5886-1KG | Not a hazardous substance |
| Collagen Type-1Solution | Sigma | S8045-500G | |
| Electrodes | Sigma | S-0876 | |
| EMEM | Gibco by Life Technologies | 25200-056 | |
| Fetal bovine serum | Corning | 356234 | Used as Extracellular matrix |
| Fluoxetine | Qiagen | 74104 | |
| Gentamicin | ATCC | 30-2003 | Cell culture Media |
| Glycin | Cell Signaling, Danvers, MA | ||
| Hepes | Roche | 11836145001 | |
| Indomethacin | Gibco by Life Technologies | 15070-063 | |
| K2HPO4 | Gibco by Life Technologies | 15710-064 | |
| KOH | Gibco by Life Technologies | 15630-080 | |
| L-ascorbic acid | Gibco by Life Technologies | 10082147 | |
| Liquid scintillation counter | Gibco by Life Technologies | 70013–032 | |
| LSM710 Meta | Physiologic Instruments, San Diego, CA | EM-CSYS-8 | |
| Mannitol | Physiologic Instruments, San Diego, CA | P2304 | |
| Matrigel | Physiologic Instruments, San Diego, CA | VCC MC8 | |
| MgCl2 | Physiologic Instruments, San Diego, CA | DM MC6 | |
| Multichannel Voltage/current Clamp | Physiologic Instruments, San Diego, CA | P2300 | |
| NaCl | Physiologic Instruments, San Diego, CA | P2023-100 | |
| NaCl | Fisher Scientific, Hampton, NH | BP1423 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | S5886 | |
| Normal Goat Serum (10%) | Fisher Scientific, Hampton, NH | S233 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | P288 | |
| Pen-Strp | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | C3881 | |
| Protein assay reagent | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | 10420 | |
| Proteinase Inhibitor Cocktail | MEDOX, Chicago, IL | style G- 12300 | |
| RNA easy Mini kit | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | M4125 | |
| Single Channel Electrode Input Module | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | A92902 | |
| Sliders for snapwell Chambers | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | H9523 | |
| Sodium Phosphate (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | F132 | |
| Sodium-Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | T7039 | |
| TGF-β1 | Perkin-Elmer,Waltham, MA | NFT1167250UC | |
| TritonX-100 | Packard Instruments, Downers Grove, IL | B1600 | |
| Trypsin EDTA | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | 221473 | |
| Tween-20 | Bio Rad Laboratories, Hercules, CA | 5000006 | |
| Ussing Chamber (chamber only) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | I7378 | |
| Ussing Chamber Systems | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | A1296 |
References
- Simon-Assmann, P., Turck, N., Sidhoum-Jenny, M., Gradwohl, G., Kedinger, M. In vitro models of intestinal epithelial cell differentiation. Cell Biol Toxicol. 23 (4), 241-256 (2007).
- Shen, C., Meng, Q., Zhang, G. Design of 3D printed insert for hanging culture of Caco-2 cells. Biofabrication. 7 (1), 015003 (2014).
- Jaffe, A. B., Kaji, N., Durgan, J., Hall, A. Cdc42 controls spindle orientation to position the apical surface during epithelial morphogenesis. J Cell Biol. 183 (4), 625-633 (2008).
- Martel, F., Monteiro, R., Lemos, C. Uptake of serotonin at the apical and basolateral membranes of human intestinal epithelial (Caco-2) cells occurs through the neuronal serotonin transporter (SERT). J Pharmacol Exp Ther. 306 (1), 355-362 (2003).
- Gill, R. K., et al. Function, expression, and characterization of the serotonin transporter in the native human intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294 (1), G254-G262 (2008).
- Esmaili, A., et al. Enteropathogenic Escherichia coli infection inhibits intestinal serotonin transporter function and expression. Gastroenterology. 137 (6), 2074-2083 (2009).
- Wade, P. R., et al. Localization and function of a 5-HT transporter in crypt epithelia of the gastrointestinal tract. J Neurosci. 16 (7), 2352-2364 (1996).
- Clarke, L. L. A guide to Ussing chamber studies of mouse intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296 (6), G1151-G1166 (2009).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Vedeler, A., Pryme, I. F., Hesketh, J. E. Insulin induces changes in the subcellular distribution of actin and 5′-nucleotidase. Mol Cell Biochem. 108 (1), 67-74 (1991).
- Botvinkin, A. D., Selimov, M. A., Zgurskaia, G. N., Kulikov, L. G., Aksenova, T. A. [Detection of rabies virus antibodies in human blood serum by an immunoenzyme method]. Vopr Virusol. 31 (3), 333-334 (1986).
- Woods, G. L., Mills, R. D. Effect of dexamethasone on detection of herpes simplex virus in clinical specimens by conventional cell culture and rapid 24-well plate centrifugation. J Clin Microbiol. 26 (6), 1233-1235 (1988).
- Chase, A. O. Acyclovir for shingles. Br Med J (Clin Res Ed. 295 (6603), 926-927 (1987).
- Churchill, P. F., Churchill, S. A., Martin, M. V., Guengerich, F. P. Characterization of a rat liver cytochrome P-450UT-H cDNA clone and comparison of mRNA levels with catalytic activity. Mol Pharmacol. 31 (2), 152-158 (1987).
- Steiner, M., Tateishi, T. Distribution and transport of calcium in human platelets. Biochim Biophys Acta. 367 (2), 232-246 (1974).
- McClelland, M., Nelson, M., Cantor, C. R. Purification of Mbo II methylase (GAAGmA) from Moraxella bovis: site specific cleavage of DNA at nine and ten base pair sequences. Nucleic Acids Res. 13 (20), 7171-7182 (1985).
- Chatterjee, I. s. h. i. t. a., K, A., Gill, R. a. v. i. n. d. e. r. . K., Alrefai, W. a. d. d. a. h. . A., Dudeja, P. r. a. d. e. e. p. . K. 3D Cell Culture of CaCo2: A Better Model to Study the Functionality and Regulation of Intestinal Ion Transporters. Gastroenterology. 146 (5, Supplement 1), S-654 (2014).
- Fagg, R. H., Hyslop, N. S. Isolation of a variant strain of foot-and-mouth disease virus (type O) during passage in partly immunized cattle. J Hyg (Lond). 64 (4), 397-404 (1966).
- Shilkina, N. P. [The aspects of the problem of systemic vasculitis open to discussion]). Ter Arkh. 61 (12), 102-106 (1989).
- Derichs, N., et al. Intestinal current measurement for diagnostic classification of patients with questionable cystic fibrosis: validation and reference data. Thorax. 65 (7), 594-599 (2010).
