방법은 3D로 재배 원주민 소장과 카코 2 세포에서 상피 전송 단백질의 기능과 발현을 연구하는
Summary
우리는 3 차원으로 성장 카코 -2 세포를 시험관 내 세포 배양 모델 및 마우스 창자의 생체 모델을 이용하여 장내 세로토닌 운반체 (SERT) 기능과 발현의 조절을 연구하는 간단한 방법을 설명한다. 이러한 방법은 다른 상피 수송의 연구에 적용 할 수있다.
Abstract
장 상피 세포는 이물질에 대한 장벽을 제공하면서 신체의 정상적인 생리 기능에 중요한 역할을 중요 전송 및 장벽 기능이 있습니다. 손상된 상피 전송 (이온 영양 또는 약물)는 많은 질환과 관련되어 있으며, 상피 무결성 및 장내 마이크로 바이 영향으로 같은 컨베이어의 정상적인 생리 학적 기능을 넘어 연장 결과를 가져올 수있다. 기능 및 수송 단백질의 조절을 이해하는 것은 개선 된 치료 적 개입의 발전을 위해 중요하다. 상피 수송의 연구에서 가장 큰 문제는 네이티브 장 상피 세포의 중요한 기능 되풀이되었습니다 적합한 모델 시스템을 개발하고있다. 예컨대 카코-2, T-84, 및 HT-29 세포 Cl.19A 여러 시험 관내 세포 배양 모델은 일반적으로 상피 전송 연구에 사용된다. 이 세포주는 전자를 모델링에 환원 접근 방식을 나타냅니다pithelium 및 상피 미생물 작용들의 검사를 포함한 다양한 역학적 연구에서 사용되어왔다. 그러나, 세포 단일 층 정확하게 세포 – 세포 상호 작용과 생체 내 미세 환경을 반영하지 않습니다. 3D에서 자란 세포는 약물 투과 연구 모델 유망한 것으로 도시 하였다. 우리는 3 차원의 카코 -2 세포는 상피 수송을 연구하는데 사용될 수 있다는 것을 보여준다. 카코 2 세포 연구는 세포 특정 효과를 배제하고 계정에 기본 대장의 복잡성을 다른 모델로하고 있습니다 것이 중요하다. 여러 방법들이 이전에 이러한 절연 상피 세포 또는 절연 세포막 소포에 everted SAC와 같은 흡수 수송의 기능을 평가하기 위해 사용되었다. 모델에 대한 및 수송 기능의 측정을 고려하여 현장에서 문제를 가지고, 여기에서 3D 카코 -2 세포 성장과 같은 Ussing 챔버의 사용을 설명하기위한 프로토콜을 보여효과적인 접근법은 그대로 편광 장내 상피 같이 세로토닌 수송을 측정한다.
Introduction
장 상피 세포는 루멘에 유체의 분비 및 이온 다양한 수송 단백질 (채널, -ATPase를, 공동 운송 및 기) 영양소, 전해질의 흡수에 이르기까지 다양한 기능을 수행하고, 마약을 갖추고있다. 수송 단백질이 방식의 vectorial 이온 또는 분자의 이동을 허용하는 전기 화학적 구배를 생성한다. 이것은 편광 상피 세포의 정단 및 기저 세포막 반송 시스템의 비대칭 분포에 의해 달성된다. 또한, 인접하는 상피 세포 밧줄 단단한 접합부는 꼭대기 및 기저 멤브레인 도메인 사이 intramembrane 성분의 확산에 대한 장벽으로서이 과정에서 중요한 역할을한다. 네이티브 소장의 이러한 특징적인 기능을 흉내 낸 적합한 모델 시스템 (즉, 극성, 분화, 꽉 접합 무결성)은 능의 연구에 중요한상피 교통 시스템의 된 스위치들.
모델에 관해서는, 장 상피 전송 연구에 현재 사용되는 전형적인 세포주는 카코이 완전히 분화의 모델이다 소장 상피 세포를 흡수; 및 T-84 세포 또는 HT-29 서브 클론, 토굴에서 파생 된 큰 장 상피 세포 하나의 모델. 통상적으로, 이러한 세포 라인은 플라스틱 표면에 단일 층 또는 코팅 된 트랜스 웰 인서트에서 재배된다. 어느 정도 트랜스 웰 세포 배양 인서트 편광 세포 basolaterally 공급할 수 있도록하여 생체 내 환경을 닮은. 그러나, 종래의 2 차원 배양 시스템에 제한은 세포가 인공 편평하고 단단한 표면에 적응하도록 강요된다는 것이다. 따라서, 원시 상피 생리 복잡성 정확하게 차원 시스템에 반영되지 않는다. 이 제한은 예컨대 젤라틴 단백질 mixtur 같은 특정 미세 차원에서 세포를 성장하는 방법에 의해 극복되었다즉, 세포 외 매트릭스 성분 (2, 3)의 종류를 포함. 그럼에도 불구하고, 체외 배양 여러 세포 유형과 장내 영역 특정 구조를 갖는 장 상피의 복잡성을 시뮬레이션 할 수있다. 따라서, 세포 배양 모델을 이용하여 연구를 기본 대장에 추가 검증을 요구한다. 체외 3D 세포 배양 및 마우스 장 점막을 사용하여, 우리는 장 세로토닌 수송 (SLC6A4, SERT)의 조절을 연구하기 위해 여기에 간단한 방법을 설명합니다.
의존적 과정 – SERT 수송이 급격히 나 + / CL을 통해 운반하여, 중요한 호르몬 및 신경 전달 물질 5- 하이드 록시 (5-HT)의 세포 외 가용성을 조절한다. SERT는 항우울제의 알려진 대상 최근 설사와 장의 염증과 같은 위장관 질환의 새로운 치료 대상으로 떠오르고있다.방법은 장내 상피 세포에서 5-HT의 흡수가 이전에 기술 된 조사합니다. 예를 들어, 플라스틱 또는 투과성 지지체 인서트 성장 카코 -2 세포는 정단 및 기저 영역에서 모두 4 플루옥세틴 성 3 H-5-HT 흡수를 나타내는 것으로 밝혀졌다. 인간 장기 기증자 소장으로부터 제조 된 절연 브러시 테두리 막 소포 (BBMVs)에 SERT 함수의 측정은 또한 우리 (5)에 의해 설명되었다. 인간 BBVMs 3 H-5-HT 흡수는 플루옥세틴 성 및 나트륨 + / CL 것으로 나타났다 – 의존성과는 300 K에서 5 nM의 m 포화 동력학을 나타내었다. 유사한 방법을 활용, 우리는 이전에 마우스 장 BBMVs 6 세 H-5-HT 흡수로 SERT 기능을 측정 하였다. 그러나, 순수한 세포막 소포의 제조 조직 점막 많은 양을 필요로한다. 예 radiog 같은 다른 방법3 H-5-HT 흡수 사이트의 raphic 시각화는 또한 기니 돼지와 쥐 소장 (7) 이전에 표시되었습니다.
Ussing 챔버 여러 상피 조직에 걸쳐 이온, 영양분, 약물의 이동을 측정하는 이상의 생체 시스템을 제공한다. Ussing 챔버 기술의 주요 장점은 그대로 편광 장 상피의 전기 및 전송 파라미터의 정확한 측정을 가능하게한다는 것이다. 또한, 내장 신경 근육 시스템의 영향을 최소화하기 위해, 장 점막의 seromuscular 박리는 상피 8 수송의 조절을 조사하기 위해 수행 될 수있다.
우리는 젤라틴 단백질에 3D로 성장 카코이 세포는 별개의 혀끝과 기저 마커를 발현하는 중공 루멘을 형성하는 것을 보여줍니다. 이 세포들은 2D 카코이 세포에 비해 SERT의 높은 표현을 보여줍니다. 방법 3D 세포를 성장하고 퍼가기하기rform의 면역 염색 또는 RNA 및 단백질 추출 기술되어있다. 또한, 우리는 Ussing 챔버 기술을 이용하여, 소장 점막 TGF-β1하는다면 발현 성 시토 킨에 의해 SERT 및 규제 기능을 연구하는 방법을 설명한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
장내 트랜스 10, 11, 12, 13, 14, 15 공부 상피 단층 편광으로 완전히 분화 카코 -2 세포 단층을 광범위하게 사용되어왔다. 그러나, 장 상피 세포의 생체 조직을 모방하는 3 차원의 카코 -2 문화의 발달에 상당한 관심이 있었다. 장 상피 세포에 대한 3 차원 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Mr. Christopher Manzella, MD/PhD student in the RKG laboratory, for helping to edit and proofread our manuscript.
Materials
| 10X PBS | ATCC | ATCC® HTB37™ | Cells |
| 10X PBS | Carl Zeiss | Microsope for confocal Imaging | |
| 3[H]-5-HT | LabtekII | 152453 | Culturing cells for microscopy |
| 5-HT | Gibco | 70013-032 | Not a hazardous substance |
| 95%O2- 5%Co2 cylinder | KPL | 71-00-27 | Not a hazardous substance |
| Agar (for Agar plates) | Fischer | BP151-100 | Acute toxicity, Ora |
| Agar (for electrode) | Sigma | G7126-1KG | Not a hazardous substance |
| Alexa FluorPhalloidin | Sigma | C3867-1VL | Not a hazardous substance |
| BSA | Sigma | P6148-500G | Harmful if swallowed or if inhaled |
| CaCl2 | LifeTechnologies | A12380 | Not a hazardous substance |
| CaCo2 Cells | Sigma | A8806-5G | Not a hazardous substance |
| Cell lysis Buffer | Fischer | BP337-100 | Not a hazardous substance |
| Chabered slides | Sigma | S5886-1KG | Not a hazardous substance |
| Collagen Type-1Solution | Sigma | S8045-500G | |
| Electrodes | Sigma | S-0876 | |
| EMEM | Gibco by Life Technologies | 25200-056 | |
| Fetal bovine serum | Corning | 356234 | Used as Extracellular matrix |
| Fluoxetine | Qiagen | 74104 | |
| Gentamicin | ATCC | 30-2003 | Cell culture Media |
| Glycin | Cell Signaling, Danvers, MA | ||
| Hepes | Roche | 11836145001 | |
| Indomethacin | Gibco by Life Technologies | 15070-063 | |
| K2HPO4 | Gibco by Life Technologies | 15710-064 | |
| KOH | Gibco by Life Technologies | 15630-080 | |
| L-ascorbic acid | Gibco by Life Technologies | 10082147 | |
| Liquid scintillation counter | Gibco by Life Technologies | 70013–032 | |
| LSM710 Meta | Physiologic Instruments, San Diego, CA | EM-CSYS-8 | |
| Mannitol | Physiologic Instruments, San Diego, CA | P2304 | |
| Matrigel | Physiologic Instruments, San Diego, CA | VCC MC8 | |
| MgCl2 | Physiologic Instruments, San Diego, CA | DM MC6 | |
| Multichannel Voltage/current Clamp | Physiologic Instruments, San Diego, CA | P2300 | |
| NaCl | Physiologic Instruments, San Diego, CA | P2023-100 | |
| NaCl | Fisher Scientific, Hampton, NH | BP1423 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | S5886 | |
| Normal Goat Serum (10%) | Fisher Scientific, Hampton, NH | S233 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | P288 | |
| Pen-Strp | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | C3881 | |
| Protein assay reagent | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | 10420 | |
| Proteinase Inhibitor Cocktail | MEDOX, Chicago, IL | style G- 12300 | |
| RNA easy Mini kit | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | M4125 | |
| Single Channel Electrode Input Module | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | A92902 | |
| Sliders for snapwell Chambers | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | H9523 | |
| Sodium Phosphate (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | F132 | |
| Sodium-Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | T7039 | |
| TGF-β1 | Perkin-Elmer,Waltham, MA | NFT1167250UC | |
| TritonX-100 | Packard Instruments, Downers Grove, IL | B1600 | |
| Trypsin EDTA | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | 221473 | |
| Tween-20 | Bio Rad Laboratories, Hercules, CA | 5000006 | |
| Ussing Chamber (chamber only) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | I7378 | |
| Ussing Chamber Systems | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | A1296 |
References
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