Methoden Epithelial Transportprotein Funktion und Expression in Mutterdarm und Caco-2-Zellen gezüchtet in 3D zu studieren
Summary
Wir beschreiben einfache Methoden der Regulierung der intestinalen Serotonintransporter zu studieren (SERT) Funktion und Expression einer in vitro Zellkulturmodell von Caco-2 – Zellen gezüchtet in 3D und eine ex – vivo – Modell der Maus – Darm verwendet wird . Diese Verfahren sind anwendbar auf die Untersuchung von anderen epithelialen Transportern.
Abstract
Das Darmepithel hat wichtige Transport- und Barrierefunktionen, die Schlüsselrollen in normalen physiologischen Funktionen des Körpers spielen, während eine Barriere gegen Fremdpartikeln. Impaired epithelialen Transport (ion, Nährstoff oder Arzneimittel) wurden mit vielen Krankheiten verbunden und können Folgen haben, die über die normalen physiologischen Funktionen der Transportunternehmen, wie beispielsweise durch Beeinflussung epithelialen Integrität und den Darm microbiome verlängern. die Funktion und die Regulierung der Transportproteine zu verstehen, ist für die Entwicklung von verbesserten therapeutischen Interventionen kritisch. Die größte Herausforderung bei der Untersuchung von epithelialen Transport entwickelt ein geeignetes Modellsystem, das wichtige Funktionen der nativen intestinalen Epithelzellen rekapituliert. Mehrere in vitro – Zellkulturmodellen, wie Caco-2, T-84 und HT-29-Zellen werden typischerweise Cl.19A in epithelialen Transport Forschung eingesetzt. Diese Zelllinien stellen einen reduktionistischen Ansatz zur Modellierung der epithelium und wurden in vielen mechanistische Studien verwendet worden, einschließlich der Prüfung der epithelial-mikrobiellen Wechselwirkungen. Allerdings Zellmonolayern genau nicht Zell-Zell – Interaktionen reflektieren und die in – vivo – Mikroumgebung. Die Zellen in 3D gewachsen sind, werden vielversprechende Modelle für Studien Arzneimittelpermeabilität gezeigt. Wir zeigen, dass Caco-2-Zellen in 3D verwendet werden können epithelialen Transporter zu studieren. Es ist auch wichtig, dass Studien in Caco-2-Zellen mit anderen Modellen ergänzt werden zellspezifische Effekte auszuschließen und die Komplexität des nativen Darm zu berücksichtigen. Mehrere Verfahren zuvor verwendet wurden, um die Funktionalität von Transportern, wie umgestülpte Sack und die Aufnahme in isolierten Epithelzellen oder in isolierten Plasmamembranvesikel zu beurteilen. Unter Berücksichtigung der Herausforderungen auf dem Gebiet in Bezug auf Modelle und die Messung der Transportfunktion, zeigen wir hier ein Protokoll Caco-2-Zellen in 3D zu wachsen und die Verwendung eines Ussingkammer als beschreibenwirksamer Ansatz Serotonin-Transport, wie in intakten polarisierten Darmepithelien zu messen.
Introduction
Das Darmepithel ist mit verschiedenen Transportproteine (Kanäle, ATPasen, Co-Transporter und Austauscher) ausgestattet, die aus der Absorption von Nährstoffen reichen, Elektrolyten und Medikamente zur Sekretion von Flüssigkeit und Ionen in dem Lumen zahlreiche Funktionen ausführen. Transportproteine erzeugen elektrochemischen Gradienten, der die Bewegung von Ionen oder Molekülen in vektorieller Weise ermöglichen. Dies wird durch die asymmetrische Verteilung der Verkehrssysteme in den apikalen und basolateralen Membranen polarisierter Epithelzellen erreicht. Zusätzlich tight junctions, die benachbarten Epithelzellen anbinden, eine wichtige Rolle in diesem Prozess spielen, indem sie als Barriere gegen die Diffusion von Komponenten intramembranären zwischen den apikalen und basolateralen Membrandomänen dienen. Geeignete Modellsysteme , die diese charakteristischen Eigenschaften des nativen Darms (dh Polarität, Differenzierung und tight junction Integrität) nachahmt sind entscheidend für die Untersuchung der functionalität von epithelialen Transportsysteme.
In Bezug auf die Modelle, sind die typischen Zelllinien, die derzeit in Darmepithel-Verkehrsforschung Caco-2, ein Modell der ausdifferenzierten, saugfähig Dünndarm-Epithelzellen; und T84 – Zellen oder HT-29 Subklone, Modelle der Krypta abgeleiteten großen intestinalen Epithelzellen 1. Herkömmlicherweise werden diese Zelllinien als Monoschichten in Kunststoffoberflächen oder in beschichteten Transwell-Einsätzen gewachsen. Trans-Well – Zellkultur – Einsätze zu einem gewissen Grad ähneln der in – vivo – Umgebung von polarisierten Zellen ermöglicht basolaterally zu ernähren. Jedoch ist eine Einschränkung in herkömmlichen 2D-Kultursysteme, dass die Zellen gezwungen werden, einen künstlichen, flachen und steifen Oberfläche anzupassen. Somit wird die physiologische Komplexität der nativen Epithelien nicht genau in einem 2D-System reflektiert wird. Diese Begrenzung wurde durch Methoden überwinden Zellen in 3D in einem bestimmten Mikroumgebung, wie gallertartig Protein Mixtur zu wachsene, eine Vielzahl von extrazellulären Matrixkomponenten , die 2, 3. Dennoch können die in vitro – Kulturen nicht die Komplexität des Darmepithels simulieren, die multiple Zelltypen und regionsspezifischen Architektur im Darm hat. So erfordern die Studien unter Verwendung von Zellkulturmodellen weitere Validierung im nativen Darm. Unter Verwendung der in vitro Zellkultur – 3D und Maus Darmschleimhaut, beschreiben wir hier einfache Methoden der Regulierung der Darmserotonintransporter zu studieren (SLC6A4, SERT).
Der SERT transporter regelt die extrazelluläre Verfügbarkeit eines wichtiges Hormon und Neurotransmitter 5-Hydroxytryptamin (5-HT), indem sie durch einen Na + / Cl rasch transportieren – -abhängigen Prozesses. SERT ist ein bekanntes Ziel von Antidepressiva und als ein neues therapeutisches Ziel von GI Störungen wie Durchfall und Darmentzündung kürzlich entstanden.Methods 5-HT-Aufnahme in intestinalen Epithelzellen zu untersuchen, die zuvor beschrieben wurden. Beispielsweise auf Kunststoffträger oder permeablen Einsätzen Caco-2 – Zellen wurden bei 4 Fluoxetin empfindlichen 3 H-5-HT – Aufnahme zeigen sowohl apikalen und basolateralen Domänen gewachsen gezeigt. Die Messung der SERT – Funktion in isolierten Pinsel-Vesikeln (gereinigten BBMVs) aus menschlichen Organspender Dünndarm hergestellt wurde auch von uns 5 beschrieben worden ist . 3 H-5-HT – Aufnahme in den menschlichen BBVMs wurde gezeigt , Fluoxetin empfindlich und Na + / Cl sein – -abhängigen, und es zeigte Sättigungskinetik mit einem K m von 300 nM 5. 6 Unter Verwendung ähnlicher Verfahren, auch wir vorher SERT Funktion als 3 H-5-HT – Aufnahme in Maus – Darm-gereinigten BBMVs gemessen. Jedoch erfordert die Herstellung von reinen Plasmamembran-Vesikel, eine große Menge von Gewebe-Schleimhaut. Andere Verfahren, wie die radiogphische Visualisierung von 3 H-5-HT – Aufnahme – Sites, haben auch zuvor bei Meerschweinchen und Ratten – Dünndarm 7 gezeigt.
Der Ussing-Kammer bietet eine physiologische System den Transport von Ionen, Nährstoffe und Medikamente in verschiedenen epithelialen Geweben zu messen. Der Hauptvorteil der Ussing-Kammer-Technik ist, dass es die genaue Messung der elektrischen und Transportparameter an intaktem, polarisierter Darmepithel ermöglicht. Ferner kann der Einfluss des intrinsischen neuromuskulären Systems, seromuskuläre Abisolieren von Darmschleimhaut zu minimieren 8 die Regulierung der Transporteure in dem Epithel zu untersuchen , durchgeführt werden.
Wir zeigen, dass Caco-2 in 3D gezüchteten Zellen auf gallertartig Protein ein hohles Lumen deutliche apikale und basolaterale Marker exprimieren, bilden. Diese Zellen zeigen eine höhere Expression von SERT als 2D Caco-2-Zellen. Methoden 3D-Zellen zu wachsen und zu perform Immunfärbung oder RNA und Protein-Extraktion beschrieben. Darüber hinaus beschreiben wir Verfahren SERT Funktion und Regulation von TGF-β1, ein pleiotrope Cytokine, in Dünndarmschleimhaut unter Verwendung einer Ussing-Kammer-Technik zu studieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ausdifferenzierten Monolayern Caco-2 – Zell haben ausgiebig Darm Transport zu studieren 10, 11, 12, 13, 14, 15 als polarisierte epitheliale Monolayern verwendet worden. Um jedoch die physiologischen Organisation der intestinalen Epithelzellen zu imitieren, hat es ein beträchtliches Interesse an der Entwicklung eines Caco-2-…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Mr. Christopher Manzella, MD/PhD student in the RKG laboratory, for helping to edit and proofread our manuscript.
Materials
| 10X PBS | ATCC | ATCC® HTB37™ | Cells |
| 10X PBS | Carl Zeiss | Microsope for confocal Imaging | |
| 3[H]-5-HT | LabtekII | 152453 | Culturing cells for microscopy |
| 5-HT | Gibco | 70013-032 | Not a hazardous substance |
| 95%O2- 5%Co2 cylinder | KPL | 71-00-27 | Not a hazardous substance |
| Agar (for Agar plates) | Fischer | BP151-100 | Acute toxicity, Ora |
| Agar (for electrode) | Sigma | G7126-1KG | Not a hazardous substance |
| Alexa FluorPhalloidin | Sigma | C3867-1VL | Not a hazardous substance |
| BSA | Sigma | P6148-500G | Harmful if swallowed or if inhaled |
| CaCl2 | LifeTechnologies | A12380 | Not a hazardous substance |
| CaCo2 Cells | Sigma | A8806-5G | Not a hazardous substance |
| Cell lysis Buffer | Fischer | BP337-100 | Not a hazardous substance |
| Chabered slides | Sigma | S5886-1KG | Not a hazardous substance |
| Collagen Type-1Solution | Sigma | S8045-500G | |
| Electrodes | Sigma | S-0876 | |
| EMEM | Gibco by Life Technologies | 25200-056 | |
| Fetal bovine serum | Corning | 356234 | Used as Extracellular matrix |
| Fluoxetine | Qiagen | 74104 | |
| Gentamicin | ATCC | 30-2003 | Cell culture Media |
| Glycin | Cell Signaling, Danvers, MA | ||
| Hepes | Roche | 11836145001 | |
| Indomethacin | Gibco by Life Technologies | 15070-063 | |
| K2HPO4 | Gibco by Life Technologies | 15710-064 | |
| KOH | Gibco by Life Technologies | 15630-080 | |
| L-ascorbic acid | Gibco by Life Technologies | 10082147 | |
| Liquid scintillation counter | Gibco by Life Technologies | 70013–032 | |
| LSM710 Meta | Physiologic Instruments, San Diego, CA | EM-CSYS-8 | |
| Mannitol | Physiologic Instruments, San Diego, CA | P2304 | |
| Matrigel | Physiologic Instruments, San Diego, CA | VCC MC8 | |
| MgCl2 | Physiologic Instruments, San Diego, CA | DM MC6 | |
| Multichannel Voltage/current Clamp | Physiologic Instruments, San Diego, CA | P2300 | |
| NaCl | Physiologic Instruments, San Diego, CA | P2023-100 | |
| NaCl | Fisher Scientific, Hampton, NH | BP1423 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | S5886 | |
| Normal Goat Serum (10%) | Fisher Scientific, Hampton, NH | S233 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | P288 | |
| Pen-Strp | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | C3881 | |
| Protein assay reagent | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | 10420 | |
| Proteinase Inhibitor Cocktail | MEDOX, Chicago, IL | style G- 12300 | |
| RNA easy Mini kit | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | M4125 | |
| Single Channel Electrode Input Module | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | A92902 | |
| Sliders for snapwell Chambers | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | H9523 | |
| Sodium Phosphate (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | F132 | |
| Sodium-Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | T7039 | |
| TGF-β1 | Perkin-Elmer,Waltham, MA | NFT1167250UC | |
| TritonX-100 | Packard Instruments, Downers Grove, IL | B1600 | |
| Trypsin EDTA | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | 221473 | |
| Tween-20 | Bio Rad Laboratories, Hercules, CA | 5000006 | |
| Ussing Chamber (chamber only) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | I7378 | |
| Ussing Chamber Systems | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | A1296 |
References
- Simon-Assmann, P., Turck, N., Sidhoum-Jenny, M., Gradwohl, G., Kedinger, M. In vitro models of intestinal epithelial cell differentiation. Cell Biol Toxicol. 23 (4), 241-256 (2007).
- Shen, C., Meng, Q., Zhang, G. Design of 3D printed insert for hanging culture of Caco-2 cells. Biofabrication. 7 (1), 015003 (2014).
- Jaffe, A. B., Kaji, N., Durgan, J., Hall, A. Cdc42 controls spindle orientation to position the apical surface during epithelial morphogenesis. J Cell Biol. 183 (4), 625-633 (2008).
- Martel, F., Monteiro, R., Lemos, C. Uptake of serotonin at the apical and basolateral membranes of human intestinal epithelial (Caco-2) cells occurs through the neuronal serotonin transporter (SERT). J Pharmacol Exp Ther. 306 (1), 355-362 (2003).
- Gill, R. K., et al. Function, expression, and characterization of the serotonin transporter in the native human intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294 (1), G254-G262 (2008).
- Esmaili, A., et al. Enteropathogenic Escherichia coli infection inhibits intestinal serotonin transporter function and expression. Gastroenterology. 137 (6), 2074-2083 (2009).
- Wade, P. R., et al. Localization and function of a 5-HT transporter in crypt epithelia of the gastrointestinal tract. J Neurosci. 16 (7), 2352-2364 (1996).
- Clarke, L. L. A guide to Ussing chamber studies of mouse intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296 (6), G1151-G1166 (2009).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Vedeler, A., Pryme, I. F., Hesketh, J. E. Insulin induces changes in the subcellular distribution of actin and 5′-nucleotidase. Mol Cell Biochem. 108 (1), 67-74 (1991).
- Botvinkin, A. D., Selimov, M. A., Zgurskaia, G. N., Kulikov, L. G., Aksenova, T. A. [Detection of rabies virus antibodies in human blood serum by an immunoenzyme method]. Vopr Virusol. 31 (3), 333-334 (1986).
- Woods, G. L., Mills, R. D. Effect of dexamethasone on detection of herpes simplex virus in clinical specimens by conventional cell culture and rapid 24-well plate centrifugation. J Clin Microbiol. 26 (6), 1233-1235 (1988).
- Chase, A. O. Acyclovir for shingles. Br Med J (Clin Res Ed. 295 (6603), 926-927 (1987).
- Churchill, P. F., Churchill, S. A., Martin, M. V., Guengerich, F. P. Characterization of a rat liver cytochrome P-450UT-H cDNA clone and comparison of mRNA levels with catalytic activity. Mol Pharmacol. 31 (2), 152-158 (1987).
- Steiner, M., Tateishi, T. Distribution and transport of calcium in human platelets. Biochim Biophys Acta. 367 (2), 232-246 (1974).
- McClelland, M., Nelson, M., Cantor, C. R. Purification of Mbo II methylase (GAAGmA) from Moraxella bovis: site specific cleavage of DNA at nine and ten base pair sequences. Nucleic Acids Res. 13 (20), 7171-7182 (1985).
- Chatterjee, I. s. h. i. t. a., K, A., Gill, R. a. v. i. n. d. e. r. . K., Alrefai, W. a. d. d. a. h. . A., Dudeja, P. r. a. d. e. e. p. . K. 3D Cell Culture of CaCo2: A Better Model to Study the Functionality and Regulation of Intestinal Ion Transporters. Gastroenterology. 146 (5, Supplement 1), S-654 (2014).
- Fagg, R. H., Hyslop, N. S. Isolation of a variant strain of foot-and-mouth disease virus (type O) during passage in partly immunized cattle. J Hyg (Lond). 64 (4), 397-404 (1966).
- Shilkina, N. P. [The aspects of the problem of systemic vasculitis open to discussion]). Ter Arkh. 61 (12), 102-106 (1989).
- Derichs, N., et al. Intestinal current measurement for diagnostic classification of patients with questionable cystic fibrosis: validation and reference data. Thorax. 65 (7), 594-599 (2010).
