אנו מתארים שיטות פשוטות כדי ללמוד את הרגולציה של טרנספורטר הסרוטונין במעיים (בהלבשה) פונקציה וביטוי באמצעות מודל תרבית תאים במבחנה של תאי קאקו-2 גדל ב -3 D ו מודל vivo לשעבר של מעי עכבר. שיטות אלו חלות על המחקר של מובילי אפיתל אחרים.
אפיתל המעי יש פונקציות תחבורת מחסום חשובות לשחק תפקיד מפתח פונקציות פיסיולוגיות של הגוף תוך מתן מחסום חלקיקים זרים. תחבורת אפיתל פגומה (יון, מזין, או תרופות) נמצאת קשורה למחלות רבות ויכולה להיות שלכות מרחיבות מעבר הפונקציות הפיזיולוגיות של מובילים, כגון באמצעות השפעה על שלמות אפיתל ואת Microbiome הבטן. הבנת הפונקציה והרגולציה של חלבוני תחבורה היא קריטית להתפתחות של התערבויות טיפוליות השתפרו. האתגר הגדול ביותר בחקר תחבורת אפיתל מפתחת מערכת מודל מתאימה כי משחזרת תכונות חשובות של תאי האפיתל במעי הילידים. כמה במבחנה מודלים תרבית תאים, כגון קאקו-2, T-84, ותאי HT-29-Cl.19A משמשים בדרך כלל במחקר תחבורה אפיתל. שורות תאים אלה מייצגות גישת רדוקציוני דוגמנות הדוארpithelium שמש במחקרים מכניסטית רבים, כולל ובדיקתם של אינטראקציות אפיתל-מיקרוביאלי. עם זאת, monolayers התא אינו משקף במדויק תאי תאי אינטראקציות ואת microenvironment vivo. תאים שגודלו 3D הראו להיות מבטיח מודלים ללימודי חדירות התרופה. אנו מראים כי תאי קאקו-2 ב -3 D יכול לשמש כדי לחקור מובילי אפיתל. כמו כן, חשוב כי מחקרים בתאי קאקו-2 הם השלימו עם מודלים אחרים כדי לשלול תופעות תא ספציפיות לקחת בחשבון את המורכבות של מעי הילידים. כמה שיטות שמשו בעבר על מנת להעריך את הפונקציונליות של מובילים, כגון צק ספיג כלפי חוץ בתאי אפיתל מבודדים או שלפוחית הממברנה מבודדת. אם ניקח בחשבון את האתגרים בתחום ביחס למודלים ומדידת פונקציה תחבורה, אנחנו מדגימים כאן פרוטוקול לגדל תאים קאקו-2 ב 3D ולתאר את השימוש בתא Ussing כקובץגישה יעילה למדידת תחבורה סרוטונין, כגון ב epithelia מעיים שלם מקוטב.
אפיתל המעי מצויד חלבוני תחבורה שונים (ערוצים, ATPases, שיתוף מובילי מחליפים) המבצעים פונקציות רבות, החל קליטת חומרים מזינות, אלקטרוליטים, ותרופות הפרשת הנוזלים ויוני לומן. חלבונים התחבורה ליצור הדרגתיים אלקטרוכימיים לאפשר תנועה של יונים או מולקולות באופן וקטורי. זו מושגת על ידי החלוקה הסימטרית של מערכות התחבורה בממברנות הפסגה ו basolateral של תאי אפיתל מקוטבים. בנוסף, צומת הדוקים, אשר לקשור תאי אפיתל סמוכים, ממלא תפקיד חשוב בתהליך זה על ידי המשרת כמחסום דיפוזיה intramembrane של רכיבים בין תחומי קרום apical ו basolateral. מערכות דגם מתאימות מחקו תכונות אופייניות הבאות של מעי הילידים (קוטבי כלומר, בידול, ויושרת צומת חזקה) הם קריטיות עבור המחקר של functionality של מערכות תחבורה אפיתל.
בנוגע למודלים, שורות התאים האופייניות בשימוש כיום במחקר תחבורת האפיתל במעי הם קאקו-2, מודל של בדיל באופן מלא, קליטה תא אפיתל מעי דק; ותאי T-84 או HT-29 subclones, מודלים של תאים אפיתל במעי גדול הנגזרות הקריפטה 1. כמקובל, שורות תאים אלה גדלים כמו monolayers ב משטחי פלסטיק או מוסיף transwell מצופה. חוצה גם תרבית תאים מוסיף במידה מסוימת דומה בסביבה vivo בכך שהוא מאפשר לתאים מקוטבים להאכיל basolaterally. עם זאת, מגבלת מערכות תרבות 2D המקובלות היא כי התאים נאלצים להסתגל משטח מלאכותי, שטוח, ונוקשה. לפיכך, את המורכבות הפיזיולוגיות של האפיטל היליד אינה משתקפות במדויק מערכת 2D. מגבלה זו כבר להתגבר על ידי שיטות לגדל תאי 3D בתוך המיקרו-סביבה ספציפית, כגון mixtur חלבון הדביקדואר, המכיל מגוון של רכיבים התאים מטריקס 2, 3. אף על פי כן, התרבויות במבחנה לא יכול לדמות את המורכבות של האפיתל במעי, אשר יש סוגי תאים מרובים ואדריכלות המיועד לאזור ספציפי במעי. לפיכך, המחקרים באמצעות מודלי תרבית תאים דורשים אימות נוספת במעי הילידים. באמצעות תרבית תאי 3D במבחנה רירית מעי עכבר, אנו מתארים כאן שיטות פשוטות כדי ללמוד את הרגולציה של טרנספורטר הסרוטונין במעיים (SLC6A4, בהלבשה).
טרנספורטר בהלבשה מסדיר את הזמינויות התאיות של הורמון חשוב הנוירוטרנסמיטר, 5 hydroxytryptamine (5-HT), על ידי במהירות והובלתו באמצעות Na + / Cl – תהליך תלוי. בהלבשה היא מטרה ידועה של תרופות נגד דיכאון, התפתחה לאחרונה כמטרה טיפולית חדשנית של הפרעות במערכת עיכול, כמו שלשול ודלקת מעיים.שיטות לחקור ספיגת 5-HT בתאי האפיתל במעי תוארה בעבר. לדוגמא, תאי קאקו-2 גדלו על תומך פלסטיק או מוסיף חדיר הוכחו להפגין fluoxetine רגיש 3 H-5-HT ספיג הן תחומי פסגה ו basolateral 4. מדידת התפקוד בהלבשה ב מבודד מברשת גבול ממברנה שלפוחית (BBMVs) שהוכנה במעי דק תורם אנושי איבר אף תוארה על ידינו 5. ספיג 3 H-5-HT ב BBVMs האנושי הוצג להיות fluoxetine רגיש Na + / Cl – תלוי, וזה הציג קינטיקה רווי עם K m של 300 ננומטר 5. ניצול בשיטות דומות, אנחנו גם נמדדנו קודם לכן פונקציה בהלבשה כמו 3 ספיגת H-5-HT ב BBMVs עכבר מעי 6. עם זאת, הכנת שלפוחית קרום פלזמה טהורה דורשת כמות גדולה של רירית רקמות. שיטות אחרות, כגון radiogלהדמית raphic של 3 אתרים ספיגים H-5-HT, גם הוכחה בעבר שרקן ומעי עכברוש קטנים 7.
תא Ussing מספק מערכת פיזיולוגית יותר למדוד את התחבורה של יונים, חומרים מזינים, וסמים פני רקמות שונות אפיתל. היתרון העיקרי של הטכניקה קאמרית Ussing הוא שהיא מאפשרת מדידה מדויקת של פרמטרים חשמליים והובלה של שלם, אפיתל המעי מקוטב. יתר על כן, כדי למזער את ההשפעה של מערכת עצבית-שרירית מהותי, הפשטה seromuscular של רירית המעי ניתן לבצע כדי לחקור את הרגולציה של מובילי באפיתל 8.
אנו מראים כי קאקו-2 תאים שגודלו ב -3 D על חלבון דביק יוצרים לומן חלול להביע סמני פסגה ו basolateral ברורים. תאים אלו מראים ביטוי גבוה של בהלבשה מאשר תאי 2D קאקו-2. שיטות לגדל תאי 3D וכדי peimmunostaining rform או מיצוי RNA והחלבון מתואר. בנוסף, אנו מתארים שיטות ללמוד לתפקד בהלבשה וויסות TGF-β1, ציטוקין pleiotropic, ב רירית המעי הדק בעזרת ניצול טכניקה קאמרית Ussing.
לגמרי תא בדיל קאקו-2 monolayers נעשה שימוש נרחב כמו מקוטב monolayers אפיתל ללמוד תחבורת מעיים 10, 11, 12, 13, 14, 15. עם זאת, כדי לחקות את הארגון הפיזיולוגי של תאי אפיתל במעי, חלה ?…
The authors have nothing to disclose.
We thank Mr. Christopher Manzella, MD/PhD student in the RKG laboratory, for helping to edit and proofread our manuscript.
10X PBS | ATCC | ATCC® HTB37™ | Cells |
10X PBS | Carl Zeiss | Microsope for confocal Imaging | |
3[H]-5-HT | LabtekII | 152453 | Culturing cells for microscopy |
5-HT | Gibco | 70013-032 | Not a hazardous substance |
95%O2- 5%Co2 cylinder | KPL | 71-00-27 | Not a hazardous substance |
Agar (for Agar plates) | Fischer | BP151-100 | Acute toxicity, Ora |
Agar (for electrode) | Sigma | G7126-1KG | Not a hazardous substance |
Alexa FluorPhalloidin | Sigma | C3867-1VL | Not a hazardous substance |
BSA | Sigma | P6148-500G | Harmful if swallowed or if inhaled |
CaCl2 | LifeTechnologies | A12380 | Not a hazardous substance |
CaCo2 Cells | Sigma | A8806-5G | Not a hazardous substance |
Cell lysis Buffer | Fischer | BP337-100 | Not a hazardous substance |
Chabered slides | Sigma | S5886-1KG | Not a hazardous substance |
Collagen Type-1Solution | Sigma | S8045-500G | |
Electrodes | Sigma | S-0876 | |
EMEM | Gibco by Life Technologies | 25200-056 | |
Fetal bovine serum | Corning | 356234 | Used as Extracellular matrix |
Fluoxetine | Qiagen | 74104 | |
Gentamicin | ATCC | 30-2003 | Cell culture Media |
Glycin | Cell Signaling, Danvers, MA | ||
Hepes | Roche | 11836145001 | |
Indomethacin | Gibco by Life Technologies | 15070-063 | |
K2HPO4 | Gibco by Life Technologies | 15710-064 | |
KOH | Gibco by Life Technologies | 15630-080 | |
L-ascorbic acid | Gibco by Life Technologies | 10082147 | |
Liquid scintillation counter | Gibco by Life Technologies | 70013–032 | |
LSM710 Meta | Physiologic Instruments, San Diego, CA | EM-CSYS-8 | |
Mannitol | Physiologic Instruments, San Diego, CA | P2304 | |
Matrigel | Physiologic Instruments, San Diego, CA | VCC MC8 | |
MgCl2 | Physiologic Instruments, San Diego, CA | DM MC6 | |
Multichannel Voltage/current Clamp | Physiologic Instruments, San Diego, CA | P2300 | |
NaCl | Physiologic Instruments, San Diego, CA | P2023-100 | |
NaCl | Fisher Scientific, Hampton, NH | BP1423 | |
NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | S5886 | |
Normal Goat Serum (10%) | Fisher Scientific, Hampton, NH | S233 | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | P288 | |
Pen-Strp | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | C3881 | |
Protein assay reagent | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | 10420 | |
Proteinase Inhibitor Cocktail | MEDOX, Chicago, IL | style G- 12300 | |
RNA easy Mini kit | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | M4125 | |
Single Channel Electrode Input Module | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | A92902 | |
Sliders for snapwell Chambers | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | H9523 | |
Sodium Phosphate (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | F132 | |
Sodium-Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | T7039 | |
TGF-β1 | Perkin-Elmer,Waltham, MA | NFT1167250UC | |
TritonX-100 | Packard Instruments, Downers Grove, IL | B1600 | |
Trypsin EDTA | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | 221473 | |
Tween-20 | Bio Rad Laboratories, Hercules, CA | 5000006 | |
Ussing Chamber (chamber only) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | I7378 | |
Ussing Chamber Systems | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | A1296 |