Métodos de estudo epitelial Transporte função das proteínas e Expressão em Native Intestino e Caco-2 células cultivadas em 3D
Summary
Nós descrevemos métodos simples para o estudo da regulação da função intestinal transportador de serotonina (SERT) e de expressão, utilizando um modelo in vitro de células de cultura de células Caco-2 cultivadas em 3D e um modelo ex vivo de intestino de rato. Estes métodos são aplicáveis para o estudo de outros transportadores epiteliais.
Abstract
O epitélio intestinal tem importantes funções de transporte e de barreira que desempenham um papel-chave nas funções fisiológicas normais do corpo, proporcionando uma barreira para partículas estranhas. transporte epitelial prejudicada (íon, nutrientes, ou drogas) tem sido associada a muitas doenças e pode ter consequências que ultrapassam as funções fisiológicas normais dos transportadores, como por influenciar a integridade do epitélio e o microbioma intestinal. Compreendendo a função e a regulação das proteínas de transporte é crítico para o desenvolvimento de intervenções terapêuticas melhoradas. O maior desafio no estudo do transporte epitelial é o desenvolvimento de um sistema modelo adequado que recapitula características importantes das células epiteliais intestinais nativas. Vários modelos in vitro de cultura de células, tais como células Caco-2, T-84, e células HT-29-Cl.19A são normalmente utilizados em pesquisa de transporte epitelial. Estas linhas celulares representam uma abordagem reducionista para modelar o epithelium e têm sido utilizados em vários estudos mecanicistas, incluindo o seu exame de interacções epiteliais-microbiana. No entanto, as monocamadas de células não reflectem com precisão as interacções célula-célula e o microambiente in vivo. As células cultivadas em 3D mostraram-se promissores modelos para estudos de permeabilidade de drogas. Mostra-se que as células Caco-2 em 3D podem ser utilizados para estudar os transportadores epiteliais. É também importante que os estudos em células Caco-2 são complementados com outros modelos para excluir efeitos específicos de células e para ter em conta a complexidade do intestino nativo. Vários métodos têm sido anteriormente utilizados para avaliar a funcionalidade de transportadores, como o saco evertido e absorção nas células epiteliais isolados ou em vesículas da membrana do plasma isoladas. Levando em consideração os desafios no campo com respeito a modelos ea medição da função de transporte, demonstramos aqui um protocolo para crescer células Caco-2 em 3D e descrevem o uso de uma câmara Ussing como umabordagem eficaz para medir o transporte da serotonina, como no epitélio intestinal polarizadas intactas.
Introduction
O epitélio intestinal é equipado com várias proteínas de transporte (canais, ATPases, co-transportadores e trocadores) que realizam numerosas funções que vão desde a absorção de nutrientes, electrólitos, e medicamentos para a secreção de fluido e de iões no lúmen. proteínas de transporte gerar gradientes electroquímicos que permitem o movimento de iões ou moléculas de um modo vectorial. Isto é conseguido por as distribuições assimétricas de os sistemas de transporte nas membranas basolaterais e apicais de células epiteliais polarizadas. Além disso, as junções apertadas, que amarrar as células epiteliais adjacentes, desempenham um papel importante neste processo, servindo como uma barreira para a difusão dos componentes intramembranar entre os domínios de membrana apical e basolateral. Sistemas modelo adequado que mimetizam estas características do intestino nativo (isto é, a polaridade, a diferenciação e a integridade junção estanque) são críticos para o estudo da functionalidade de sistemas de transporte epiteliais.
No que diz respeito aos modelos, as linhas celulares típicas actualmente utilizadas na pesquisa de transporte epitelial intestinal Caco-2 são, de um modelo completamente diferenciado, absorventes de células epiteliais do intestino delgado; e células T84 ou HT-29 subclones, modelos de grandes células epiteliais intestinais derivado 1-crypt. Convencionalmente, estas linhas de células são crescidas como monocamadas em superfícies de plástico ou em inserções Transwell revestidas. Trans poços de cultura de células inserções em certa medida, assemelhar-se ao ambiente in vivo, permitindo que as células polarizadas para alimentar basolateralmente. No entanto, uma limitação dos sistemas de cultura 2D convencionais é que as células são forçadas a se adaptar a uma superfície artificial, plana e rígida. Assim, a complexidade fisiológica do epitélio nativa não é reflectida de forma adequada num sistema 2D. Esta limitação foi superada através de métodos de cultivar células em 3D em um microambiente específico, como MIXTUR proteína gelatinosaE, contendo uma variedade de componentes da matriz extracelular 2, 3. No entanto, as culturas in vitro não pode simular a complexidade do epitélio intestinal, o que tem vários tipos de células e a arquitectura específica da região no intestino. Assim, os estudos utilizando modelos de cultura celular exigir uma validação adicional no intestino nativo. Utilizando a cultura de células in vitro 3D e da mucosa intestinal do rato, que descrevem aqui métodos simples para estudar a regulação do transportador de serotonina intestinal (SLC6A4, SERT).
O transportador SERT regula a disponibilidade extracelular de uma hormona importante neurotransmissor e, 5-hidroxitriptamina (5-HT), transportando-o através de uma rápida Na + / Cl – dependente de processo. SERT é um alvo conhecido dos anti-depressivos e surgiu recentemente como um novo alvo terapêutico de distúrbios gastrointestinais, como diarréia e inflamação intestinal.Métodos para investigar absorção de 5-HT, em células epiteliais intestinais foram anteriormente descritos. Por exemplo, Caco-2 células cultivadas em suportes de plástico ou inserções permeáveis têm mostrado exibir absorção 3 H-5-HT fluoxetina e minúsculas em ambos os domínios basolaterais e apicais 4. A medida da função SERT em escova isolado beira da Membrana As vesículas (BBMVs) preparado a partir de doadores de órgãos humanos intestino delgado, também foi descrita por 5 nós. 3 absorção de H-5-HT em BBVMs humanos mostrou-se fluoxetina-sensível e Na + / Cl – dependente, e exibiu uma cinética de saturação com um K m de 300 nM 5. Utilizando métodos semelhantes, também medido anteriormente função de SERT como 3 absorção de H-5-HT no rato BBMVs intestinais 6. No entanto, a preparação de vesículas de membrana de plasma puro requer uma grande quantidade de tecido de mucosa. Outros métodos, tais como o radiographic visualização de locais de recaptação 3 H-5-HT, têm também sido mostrado anteriormente na cobaia e de ratazana intestino delgado 7.
A câmara Ussing proporciona um sistema mais fisiológico para medir o transporte de iões, nutrientes, e medicamentos através de vários tecidos epiteliais. A principal vantagem da técnica de câmara Ussing é que ele permite a medição precisa dos parâmetros eléctricos e de transporte de intacta, epitélio intestinal polarizada. Além disso, para minimizar a influência do sistema neuromuscular intrínseca, de decapagem seromuscular da mucosa intestinal pode ser realizada para investigar a regulação dos transportadores no epitélio 8.
Nós demonstramos que as células Caco-2 cultivadas em 3D na proteína gelatinosa formar um lúmen oco que expressam marcadores apical e basolateral distintas. Estas células apresentam maior expressão de SERT do que as células Caco-2 2D. Métodos para cultivar células em 3D e perform imunocoloração ou extração de RNA e de proteínas são descritos. Além disso, descrevemos métodos para estudar a função SERT e regulação dos TGF-β1, uma citocina pleiotropic, na mucosa do intestino delgado, utilizando uma técnica de câmara de Ussing.
Protocol
Representative Results
Discussion
As monocamadas de células Caco-2 completamente diferenciadas foram utilizados extensivamente como monocamadas epiteliais polarizadas para estudar o transporte intestinal 10, 11, 12, 13, 14, 15. No entanto, para imitar a organização fisiológico das células epiteliais intestinais, tem havido um interesse considerável no …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Mr. Christopher Manzella, MD/PhD student in the RKG laboratory, for helping to edit and proofread our manuscript.
Materials
| 10X PBS | ATCC | ATCC® HTB37™ | Cells |
| 10X PBS | Carl Zeiss | Microsope for confocal Imaging | |
| 3[H]-5-HT | LabtekII | 152453 | Culturing cells for microscopy |
| 5-HT | Gibco | 70013-032 | Not a hazardous substance |
| 95%O2- 5%Co2 cylinder | KPL | 71-00-27 | Not a hazardous substance |
| Agar (for Agar plates) | Fischer | BP151-100 | Acute toxicity, Ora |
| Agar (for electrode) | Sigma | G7126-1KG | Not a hazardous substance |
| Alexa FluorPhalloidin | Sigma | C3867-1VL | Not a hazardous substance |
| BSA | Sigma | P6148-500G | Harmful if swallowed or if inhaled |
| CaCl2 | LifeTechnologies | A12380 | Not a hazardous substance |
| CaCo2 Cells | Sigma | A8806-5G | Not a hazardous substance |
| Cell lysis Buffer | Fischer | BP337-100 | Not a hazardous substance |
| Chabered slides | Sigma | S5886-1KG | Not a hazardous substance |
| Collagen Type-1Solution | Sigma | S8045-500G | |
| Electrodes | Sigma | S-0876 | |
| EMEM | Gibco by Life Technologies | 25200-056 | |
| Fetal bovine serum | Corning | 356234 | Used as Extracellular matrix |
| Fluoxetine | Qiagen | 74104 | |
| Gentamicin | ATCC | 30-2003 | Cell culture Media |
| Glycin | Cell Signaling, Danvers, MA | ||
| Hepes | Roche | 11836145001 | |
| Indomethacin | Gibco by Life Technologies | 15070-063 | |
| K2HPO4 | Gibco by Life Technologies | 15710-064 | |
| KOH | Gibco by Life Technologies | 15630-080 | |
| L-ascorbic acid | Gibco by Life Technologies | 10082147 | |
| Liquid scintillation counter | Gibco by Life Technologies | 70013–032 | |
| LSM710 Meta | Physiologic Instruments, San Diego, CA | EM-CSYS-8 | |
| Mannitol | Physiologic Instruments, San Diego, CA | P2304 | |
| Matrigel | Physiologic Instruments, San Diego, CA | VCC MC8 | |
| MgCl2 | Physiologic Instruments, San Diego, CA | DM MC6 | |
| Multichannel Voltage/current Clamp | Physiologic Instruments, San Diego, CA | P2300 | |
| NaCl | Physiologic Instruments, San Diego, CA | P2023-100 | |
| NaCl | Fisher Scientific, Hampton, NH | BP1423 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | S5886 | |
| Normal Goat Serum (10%) | Fisher Scientific, Hampton, NH | S233 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | P288 | |
| Pen-Strp | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | C3881 | |
| Protein assay reagent | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | 10420 | |
| Proteinase Inhibitor Cocktail | MEDOX, Chicago, IL | style G- 12300 | |
| RNA easy Mini kit | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | M4125 | |
| Single Channel Electrode Input Module | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | A92902 | |
| Sliders for snapwell Chambers | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | H9523 | |
| Sodium Phosphate (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | F132 | |
| Sodium-Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | T7039 | |
| TGF-β1 | Perkin-Elmer,Waltham, MA | NFT1167250UC | |
| TritonX-100 | Packard Instruments, Downers Grove, IL | B1600 | |
| Trypsin EDTA | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | 221473 | |
| Tween-20 | Bio Rad Laboratories, Hercules, CA | 5000006 | |
| Ussing Chamber (chamber only) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | I7378 | |
| Ussing Chamber Systems | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | A1296 |
References
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