Metoder for å studere epithelial Transport Protein Funksjon og Expression i Native tarmen og Caco-2 celler dyrket i 3D
Summary
Vi beskriver enkle metoder for å studere reguleringen av tarmserotonintransportøren (SERT) funksjon og ekspresjon ved bruk av en in vitro-cellekulturmodell av Caco-2-celler dyrket i 3D og en ex vivo-modell av mus tarmen. Disse metodene er aktuelt for studiet av andre epiteliale transportører.
Abstract
Tarmepitelet har viktige transport- og barrierefunksjoner som spiller nøkkelroller i normale fysiologiske funksjoner i kroppen samtidig som det gir en barriere mot fremmede partikler. Nedsatt epitelial transport (ion, næringsstoffer eller medikamenter) har blitt forbundet med mange sykdommer og kan ha konsekvenser som strekker seg utover de normale fysiologiske funksjoner av transportørene, for eksempel ved å påvirke epitelial integritet og tarmen mikrobiomer. Å forstå funksjon og regulering av transportproteiner er kritisk for utviklingen av forbedrede terapeutiske intervensjoner. Den største utfordringen i studiet av epiteliale transport er å utvikle en passende modellsystem som sammenfatter viktige trekk ved de innfødte intestinale epitelceller. Flere in vitro cellekultur modeller, slik som Caco-2, T-84, og HT-29-celler Cl.19A brukes vanligvis i epithelial transport forskning. Disse cellelinjene representerer en reductionist tilnærming for å modellere epithelium og har vært brukt i mange mekanistiske studier, inkludert deres undersøkelse av epitel-mikrobiell interaksjoner. Men ikke cellemono ikke nøyaktig gjenspeiler celle-celle interaksjoner og in vivo mikromiljøet. Celler dyrket i 3D har vist seg å være lovende modeller for medikament permeabilitet studier. Vi viser at Caco-2-celler i 3D, kan brukes til å studere epiteliale transportører. Det er også viktig at studier i Caco-2-celler er supplert med andre modeller for å utelukke celle spesifikke effekter og for å ta hensyn til kompleksiteten til det native tarmen. Flere metoder er tidligere blitt brukt til å vurdere funksjonaliteten av transportører, slik som vrengte sekk og opptak i isolerte epitelceller eller i isolerte plasmamembranvesiklene. Tatt i betraktning de utfordringer i felt med hensyn til modell og måling av transportfunksjon, viser vi her en protokoll for å vokse Caco-2-celler i 3D og beskriver bruken av en Ussing kammer som eneffektiv metode for å måle serotonin transport, for eksempel i intakte polariserte intestinale epitel.
Introduction
Tarmepitelet er utstyrt med flere transport- proteiner (kanaler, ATPaser, co-transportører og veks) som utfører en rekke funksjoner som strekker seg fra absorpsjon av næringsstoffer, elektrolytter, og legemidler for utskillelsen av væske og ioner i lumen. Transportproteiner generere elektrokjemiske gradienter som tillater bevegelse av ioner eller molekyler i en vektoriell måte. Dette oppnås ved de asymmetriske fordelinger av transportsystemene i den apikale og basolaterale membraner av polariserte epitelceller. I tillegg er tett veikryss, som fortøyningen tilstøtende epitelceller, spiller en viktig rolle i denne prosessen ved å tjene som en barriere mot intramembrane diffusjon av komponentene mellom de apikale og basolaterale membran domener. Passende modellsystemer som etterligner disse karakteristiske trekk ved de innfødte tarmen (dvs. polaritet, differensiering, og stram krysset integritet) er kritisk for studiet av functiodis- posisjon av epiteliale transportsystemer.
Med hensyn til modeller, den typiske cellelinjer som benyttes for tiden i intestinal epithelial transport forskning er Caco-2, en modell av fullt differensiert, absorberende små intestinale epitelceller; og T84 celler eller HT-29 subkloner, modeller av krypten-avledet store intestinale epitelceller 1. Vanligvis er disse cellelinjer dyrket som monolag i plastoverflater eller i belagte Transwell innsatser. Trans-brønns celledyrkningsinnsatser til en viss grad ligner in vivo miljø ved at polariserte celler til å mate basolaterally. Imidlertid er en begrensning i konvensjonelle 2D kultursystemer at cellene blir tvunget til å tilpasse seg en kunstig, flat og stiv overflate. Således er den fysiologiske kompleksiteten av det native epitel ikke nøyaktig gjenspeiles i et 2D-system. Denne begrensningen har blitt overvunnet ved fremgangsmåter for å dyrke celler i 3D i en bestemt mikromiljøet, for eksempel gelatinaktig protein mixture, som inneholder en rekke ekstracellulære matriks-komponentene 2, 3. Ikke desto mindre kan de in vitro kulturer ikke simulere kompleksiteten i tarmepitelet, som har flere celletyper og regionspesifikke arkitektur i tarmen. Dermed studier ved hjelp av cellekultur modeller kreve ytterligere validering på mors tarmen. Ved hjelp av in vitro cellekultur 3D og mus intestinal mucosa, beskriver vi her enkle metoder for å studere reguleringen av tarmserotonintransportøren (SLC6A4, SERT).
Den SERT transporter regulerer den ekstracellulære tilgjengeligheten av et viktig hormon og nevrotransmitter, 5-hydroksytryptamin (5-HT), ved raskt å transportere den gjennom en Na + / Cl – -avhengig prosess. Sert er et kjent mål for anti-depressiva og har nylig dukket opp som en roman terapeutisk mål av GI lidelser, for eksempel diaré og tarmbetennelse.Metoder for å undersøke 5-HT-opptak i intestinale epitelceller er tidligere blitt beskrevet. For eksempel har Caco-2-celler dyrket på plast bærere eller gjennomtrengelige innsatser blitt vist å oppvise fluoksetin-sensitive 3H-5-HT gjenopptak ved begge apikale og basolaterale domener 4. Målingen av SERT funksjon i isolert børstegrense membranvesikler (BBMVs) fremstilt fra menneskeorgan givertynntarmen er også blitt beskrevet av oss 5. 3-H-5-HT gjenopptak i humane BBVMs ble vist å være fluoksetin-sensitive og Na + / Cl – -avhengig, og det oppviste metningskinetikk med en K m av 300 nM 5. Ved å benytte lignende fremgangsmåter, har vi også tidligere målte SERT funksjon som 3H-5-HT-opptak i mus intestinal BBMVs 6. Imidlertid er fremstilling av rene plasmamembranvesiklene krever en stor mengde av vev mucosa. Andre metoder, slik som radiographic visualisering av 3 H-5-HT-opptakssetene, har også vært vist tidligere i marsvin og rotte tynntarmen 7.
Den Ussing kammer gir et mer fysiologisk system for å måle transport av ioner, næringsstoffer, medikamenter og på tvers av ulike epitelvev. Den største fordelen med den Ussing kammer teknikken er at den muliggjør nøyaktig måling av de elektriske og transportparameterne i intakte, polarisert tarmepitelet. Videre, for å minimalisere påvirkning av den iboende nevromuskulære system, kan seromuskulære stripping av tarmslimhinnen bli utført for å undersøke regulering av transportører i epitelet 8.
Vi viser at Caco-2 celler dyrket i 3D på geléaktig protein danner en hul lumen uttrykke tydelige apikale og basolaterale markører. Disse cellene viser høyere uttrykk av Sert enn 2D Caco-2 celler. Fremgangsmåter for å dyrke 3D-celler og for å perform farging eller RNA og proteinutvinning er beskrevet. I tillegg, beskriver vi metoder for å studere SERT funksjon og regulering av TGF-β1, en pleiotropisk cytokin, i tynntarmslimhinne ved bruk av en Ussing kammer teknikk.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fullt differensierte Caco-2-cellemonolagene har blitt brukt i stor utstrekning som polarisert epitel-monolag å studere intestinal transport 10, 11, 12, 13, 14, 15. Imidlertid, for å etterligne fysiologiske organiseringen av intestinale epitelceller, har det vært stor interesse for utvikling av en Caco-2-kultur i 3D. En re…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Mr. Christopher Manzella, MD/PhD student in the RKG laboratory, for helping to edit and proofread our manuscript.
Materials
| 10X PBS | ATCC | ATCC® HTB37™ | Cells |
| 10X PBS | Carl Zeiss | Microsope for confocal Imaging | |
| 3[H]-5-HT | LabtekII | 152453 | Culturing cells for microscopy |
| 5-HT | Gibco | 70013-032 | Not a hazardous substance |
| 95%O2- 5%Co2 cylinder | KPL | 71-00-27 | Not a hazardous substance |
| Agar (for Agar plates) | Fischer | BP151-100 | Acute toxicity, Ora |
| Agar (for electrode) | Sigma | G7126-1KG | Not a hazardous substance |
| Alexa FluorPhalloidin | Sigma | C3867-1VL | Not a hazardous substance |
| BSA | Sigma | P6148-500G | Harmful if swallowed or if inhaled |
| CaCl2 | LifeTechnologies | A12380 | Not a hazardous substance |
| CaCo2 Cells | Sigma | A8806-5G | Not a hazardous substance |
| Cell lysis Buffer | Fischer | BP337-100 | Not a hazardous substance |
| Chabered slides | Sigma | S5886-1KG | Not a hazardous substance |
| Collagen Type-1Solution | Sigma | S8045-500G | |
| Electrodes | Sigma | S-0876 | |
| EMEM | Gibco by Life Technologies | 25200-056 | |
| Fetal bovine serum | Corning | 356234 | Used as Extracellular matrix |
| Fluoxetine | Qiagen | 74104 | |
| Gentamicin | ATCC | 30-2003 | Cell culture Media |
| Glycin | Cell Signaling, Danvers, MA | ||
| Hepes | Roche | 11836145001 | |
| Indomethacin | Gibco by Life Technologies | 15070-063 | |
| K2HPO4 | Gibco by Life Technologies | 15710-064 | |
| KOH | Gibco by Life Technologies | 15630-080 | |
| L-ascorbic acid | Gibco by Life Technologies | 10082147 | |
| Liquid scintillation counter | Gibco by Life Technologies | 70013–032 | |
| LSM710 Meta | Physiologic Instruments, San Diego, CA | EM-CSYS-8 | |
| Mannitol | Physiologic Instruments, San Diego, CA | P2304 | |
| Matrigel | Physiologic Instruments, San Diego, CA | VCC MC8 | |
| MgCl2 | Physiologic Instruments, San Diego, CA | DM MC6 | |
| Multichannel Voltage/current Clamp | Physiologic Instruments, San Diego, CA | P2300 | |
| NaCl | Physiologic Instruments, San Diego, CA | P2023-100 | |
| NaCl | Fisher Scientific, Hampton, NH | BP1423 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | S5886 | |
| Normal Goat Serum (10%) | Fisher Scientific, Hampton, NH | S233 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | P288 | |
| Pen-Strp | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | C3881 | |
| Protein assay reagent | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | 10420 | |
| Proteinase Inhibitor Cocktail | MEDOX, Chicago, IL | style G- 12300 | |
| RNA easy Mini kit | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | M4125 | |
| Single Channel Electrode Input Module | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | A92902 | |
| Sliders for snapwell Chambers | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | H9523 | |
| Sodium Phosphate (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | F132 | |
| Sodium-Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | T7039 | |
| TGF-β1 | Perkin-Elmer,Waltham, MA | NFT1167250UC | |
| TritonX-100 | Packard Instruments, Downers Grove, IL | B1600 | |
| Trypsin EDTA | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | 221473 | |
| Tween-20 | Bio Rad Laboratories, Hercules, CA | 5000006 | |
| Ussing Chamber (chamber only) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | I7378 | |
| Ussing Chamber Systems | Sigma-Aldrich, St Louis, MO | A1296 |
References
- Simon-Assmann, P., Turck, N., Sidhoum-Jenny, M., Gradwohl, G., Kedinger, M. In vitro models of intestinal epithelial cell differentiation. Cell Biol Toxicol. 23 (4), 241-256 (2007).
- Shen, C., Meng, Q., Zhang, G. Design of 3D printed insert for hanging culture of Caco-2 cells. Biofabrication. 7 (1), 015003 (2014).
- Jaffe, A. B., Kaji, N., Durgan, J., Hall, A. Cdc42 controls spindle orientation to position the apical surface during epithelial morphogenesis. J Cell Biol. 183 (4), 625-633 (2008).
- Martel, F., Monteiro, R., Lemos, C. Uptake of serotonin at the apical and basolateral membranes of human intestinal epithelial (Caco-2) cells occurs through the neuronal serotonin transporter (SERT). J Pharmacol Exp Ther. 306 (1), 355-362 (2003).
- Gill, R. K., et al. Function, expression, and characterization of the serotonin transporter in the native human intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294 (1), G254-G262 (2008).
- Esmaili, A., et al. Enteropathogenic Escherichia coli infection inhibits intestinal serotonin transporter function and expression. Gastroenterology. 137 (6), 2074-2083 (2009).
- Wade, P. R., et al. Localization and function of a 5-HT transporter in crypt epithelia of the gastrointestinal tract. J Neurosci. 16 (7), 2352-2364 (1996).
- Clarke, L. L. A guide to Ussing chamber studies of mouse intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296 (6), G1151-G1166 (2009).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Vedeler, A., Pryme, I. F., Hesketh, J. E. Insulin induces changes in the subcellular distribution of actin and 5′-nucleotidase. Mol Cell Biochem. 108 (1), 67-74 (1991).
- Botvinkin, A. D., Selimov, M. A., Zgurskaia, G. N., Kulikov, L. G., Aksenova, T. A. [Detection of rabies virus antibodies in human blood serum by an immunoenzyme method]. Vopr Virusol. 31 (3), 333-334 (1986).
- Woods, G. L., Mills, R. D. Effect of dexamethasone on detection of herpes simplex virus in clinical specimens by conventional cell culture and rapid 24-well plate centrifugation. J Clin Microbiol. 26 (6), 1233-1235 (1988).
- Chase, A. O. Acyclovir for shingles. Br Med J (Clin Res Ed. 295 (6603), 926-927 (1987).
- Churchill, P. F., Churchill, S. A., Martin, M. V., Guengerich, F. P. Characterization of a rat liver cytochrome P-450UT-H cDNA clone and comparison of mRNA levels with catalytic activity. Mol Pharmacol. 31 (2), 152-158 (1987).
- Steiner, M., Tateishi, T. Distribution and transport of calcium in human platelets. Biochim Biophys Acta. 367 (2), 232-246 (1974).
- McClelland, M., Nelson, M., Cantor, C. R. Purification of Mbo II methylase (GAAGmA) from Moraxella bovis: site specific cleavage of DNA at nine and ten base pair sequences. Nucleic Acids Res. 13 (20), 7171-7182 (1985).
- Chatterjee, I. s. h. i. t. a., K, A., Gill, R. a. v. i. n. d. e. r. . K., Alrefai, W. a. d. d. a. h. . A., Dudeja, P. r. a. d. e. e. p. . K. 3D Cell Culture of CaCo2: A Better Model to Study the Functionality and Regulation of Intestinal Ion Transporters. Gastroenterology. 146 (5, Supplement 1), S-654 (2014).
- Fagg, R. H., Hyslop, N. S. Isolation of a variant strain of foot-and-mouth disease virus (type O) during passage in partly immunized cattle. J Hyg (Lond). 64 (4), 397-404 (1966).
- Shilkina, N. P. [The aspects of the problem of systemic vasculitis open to discussion]). Ter Arkh. 61 (12), 102-106 (1989).
- Derichs, N., et al. Intestinal current measurement for diagnostic classification of patients with questionable cystic fibrosis: validation and reference data. Thorax. 65 (7), 594-599 (2010).
