الكشف عن التعبير ميكرورنا في الغشاء البريتوني من الفئران باستخدام الكمي في الوقت الحقيقي ير
Summary
هنا نقدم بروتوكول للكشف عن التعبير ميكرورنا في الفئران الغشاء البريتوني باستخدام الكمي في الوقت الحقيقي عكس النسخ البلمرة سلسلة من ردود الفعل. هذه الطريقة مناسبة لدراسة الملف الشخصي التعبير ميكرورنا في الغشاء البريتوني الفئران في العديد من الحالات المرضية.
Abstract
ميكرورناس (ميرناس) هي رنا غير نكودينغ الصغيرة التي تنظم رسول رسول التعبير بعد ترانسكريبتيونالي. وقد تم التحقيق في الملف الشخصي التعبير ميرنا في مختلف الأجهزة والأنسجة في الفئران. ومع ذلك، لم يتم تأسيس أساليب موحدة لتنقية ميرناس والكشف عن التعبير في الغشاء البريتوني الفئران راسخة. قمنا بتطوير طريقة فعالة وموثوق بها لتنقية وتحديد ميرناس باستخدام الكمي في الوقت الحقيقي عكس النسخ البلمرة سلسلة من ردود الفعل (كرت-ير) في الفئران الغشاء البريتوني. يتكون هذا البروتوكول من أربع خطوات: 1) تنقية عينة الغشاء البريتوني. 2) تنقية رنا الكلي بما في ذلك ميرنا من عينة الغشاء البريتوني. 3) النسخ العكسي من ميرنا لإنتاج [كدنا]؛ و 4) كرت-ير للكشف عن التعبير ميرنا. باستخدام هذا البروتوكول، قررنا بنجاح أن التعبير عن ستة ميرناس (ميرنا-142-3p، ميرنا-21-5p، ميرنا-221-3p، ميرنا -223-3p، ميرنا -327، و ميرنا -34a-5P) زيادةبشكل ملحوظ في الغشاء البريتوني من الفئران نموذج التليف البريتوني مقارنة مع تلك الموجودة في مجموعات السيطرة. هذا البروتوكول يمكن استخدامها لدراسة الملف الشخصي للتعبير ميرنا في الغشاء البريتوني من الفئران في العديد من الحالات المرضية.
Introduction
ميكرورناس (ميرناس) قصيرة، رناس غير الشفرة التي بعد ترانسكريبتيونالي تنظيم رنا رسول (مرنا) التعبير 1 . التغيرات في التعبير عن ميرناس تنظيم التعبير عن العديد من مرناس التي تلعب الأدوار المحورية في مختلف الظروف المرضية، بما في ذلك السرطان، والتهاب، واضطرابات التمثيل الغذائي، والتليف 2 ، 3 ، 4 ، 5 ، 6 ، 7 ، 8 . لذلك، ميرناس لها إمكانات المؤشرات الحيوية الرواية والأهداف العلاجية 2 ، 3 ، 4 ، 5 ، 6 ، 7 ، 8 . وقد تم تحديد الملف الشخصي التعبير ميرنا في مختلف الفئرانوالأعضاء والأنسجة، بما في ذلك الكبد والقلب والرئة والكلى 9 . ومع ذلك، لم يتم تأسيس أساليب موحدة لتنقية وكشف عن ميرناس في الغشاء البريتوني الفئران راسخة.
الهدف العام من هذا البروتوكول هو لتنقية بنجاح وكشف ميرناس في الغشاء البريتوني الفئران. أولا، تم تجانس عينة الغشاء البريتوني باستخدام الخالط الزجاج، تليها التعرض لنظام التمزق الحيوي البوليمر في عمود تدور ميكروسنتريفوج 10 . بعد ذلك، تم تنقية مجموع الحمض النووي الريبي بما في ذلك ميرنا من عينة الغشاء البريتوني باستخدام عمود تدور غشاء السيليكا القائمة على 10 . ثم، تم تصنيعه [كدنا] من الحمض النووي الريبي مجموع المنقى باستخدام ترانسكريبتاس العكسي، بولي (A) البلمرة، و أوليغو دت التمهيدي 11 . وأخيرا، تم تحديد التعبير عن ميرنا بواسطة كرت-ير باستخدام صبغ مقحم 11 . والأساس المنطقي لهذا البروتوكول هو بأسيد على الدراسات السابقة التي أظهرت تنقية كبيرة والكشف عن ميرنا في الأنسجة عن طريق عملية بسيطة 8 ، 10 ، 11 . وقد أفيد بأن استخدام نظام تمزيق بيوليمر الحيوية في عمود تدور ميكروسنتريفوج والعمودي تدور الغشاء السيليكا الغشاء يمكن تنقية عالية الجودة الحمض النووي الريبي مجموع من الأنسجة 10 . وقد تم الإبلاغ عن طريقة توليف [كدنا] من تنقية الحمض النووي الريبي مجموع باستخدام ترانسكريبتاسيس العكسي، بولي (A) البلمرة، و أوليغو دت التمهيدي، وطريقة الكشف عن التعبير ميرنا بواسطة كرت-ير باستخدام صبغ مقحم في هذا البروتوكول لإظهار دقة عالية و حساسية 11 . وبالإضافة إلى ذلك، وهذا هو عملية بسيطة، مما يوفر الوقت ويمنع الخطأ التقني. لذلك، هذا البروتوكول مفيد في الدراسات التي تتطلب الكشف دقيقة للغاية وحساسة من ميرنا في الفئران الغشاء البريتوني في مجموعة واسعة من الحالات المرضية.
Protocol
Representative Results
Discussion
باستخدام بروتوكول المقدمة في هذه المخطوطة، ميرناس في الفئران الغشاء البريتوني تم تنقيته بنجاح وكشف باستخدام كرت-ير. موثوقية تحليل البيانات كرت-ير يعتمد على نوعية ميرناس المنقى. لذلك، قد يتم فحص نقاء ميرناس قبل كرت-ير بنسبة الامتصاصية في 260 نانومتر إلى أن في 280 نانومت?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر مياكو شيجيتا لدعمها الفني الممتاز. وقد حظي هذا العمل بدعم جزئي من جسبس كاكينهي (رقم المنحة 25461252).
Materials
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | biopolymer-shredding system in a micro centrifuge spin-column |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | silica-membrane based spin column |
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | phenol/guanidine-based lysis reagent |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | wash buffer 1 |
| Buffer RWT | Qiagen | 1067933 | wash buffer 2 |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | includes 10× Nucleics Mix containing deoxynucleotides, ribonucleotide triphosphates, and oligo-dT primers; miScript Reverse Transcriptase Mix containing poly(A) polymerase and reverse transcriptase and; miScript HiSpec buffer |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | includes QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix and miScript Universal Primer |
| RNU6-2 primer | Qiagen | MS00033740 | not disclosed |
| miRNA-142-3p primer | Qiagen | MS00031451 | 5'-UGUAGUGUUUCC UACUUUAUGGA-3' |
| miRNA-21-5p primer | Qiagen | MS00009079 | 5'-UAGCUUAUCAG ACUGAUGUUGA-3' |
| miRNA-221-3p primer | Qiagen | MS00003857 | 5'-AGCUACAUUGU CUGCUGGGUUUC-3' |
| miRNA-223-3p primer | Qiagen | MS00033320 | 5'-UGUCAGUUUG UCAAAUACCCC-3' |
| miRNA-34a-5p primer | Qiagen | MS00003318 | 5'-UGGCAGUGUCU UAGCUGGUUGU-3' |
| miRNA-327 primer | Qiagen | MS00000805 | 5'-CCUUGAGGGG CAUGAGGGU-3' |
| MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | adhesive film for 96-well reaction plate |
| QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument |
| QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument software |
| methylglyoxal | Sigma-Aldrich | M0252 | |
| Midperic | Terumo | not assign | peritoneal dialysis fluid |
| Sprague–Dawley rats | SLC | not assign |
References
- Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay. Nat Rev Genet. 11 (9), 597-610 (2010).
- Beermann, J., Piccoli, M. T., Viereck, J., Thum, T. Non-coding RNAs in Development and Disease: Background, Mechanisms, and Therapeutic Approaches. Physiol Rev. 96 (4), 1297-1325 (2016).
- Saikumar, J., Ramachandran, K., Vaidya, V. S. Noninvasive micromarkers. Clin Chem. 60 (9), 1158-1173 (2014).
- Yang, G., Yang, L., Wang, W., Wang, J., Xu, Z. Discovery and validation of extracellular/circulating microRNAs during idiopathic pulmonary fibrosis disease progression. Gene. 562 (1), 138-144 (2015).
- Zhang, T., et al. Circulating miR-126 is a potential biomarker to predict the onset of type 2 diabetes mellitus in susceptible individuals. Biochem Biophys Res Commun. , (2015).
- Zhong, X., et al. miR-21 is a key therapeutic target for renal injury in a mouse model of type 2 diabetes. Diabetologia. 56 (3), 663-674 (2013).
- Wang, J., et al. Downregulation of urinary cell-free microRNA-214 as a diagnostic and prognostic biomarker in bladder cancer. J Surg Oncol. , (2015).
- Morishita, Y., et al. MicroRNA expression profiling in peritoneal fibrosis. Transl Res. 169, 47-66 (2016).
- Minami, K., et al. miRNA expression atlas in male rat. Sci Data. 1, 140005 (2014).
- Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit. Biotechniques. 40 (1), 54-58 (2006).
- Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nat Methods. 11 (8), 809-815 (2014).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Krediet, R. T., Lindholm, B., Rippe, B. Pathophysiology of peritoneal membrane failure. Perit Dial Int. 20, S22-S42 (2000).
- Devuyst, O., Margetts, P. J., Topley, N. The pathophysiology of the peritoneal membrane. J Am Soc Nephrol. 21 (7), 1077-1085 (2010).
- Hirahara, I., Ishibashi, Y., Kaname, S., Kusano, E., Fujita, T. Methylglyoxal induces peritoneal thickening by mesenchymal-like mesothelial cells in rats. Nephrol Dial Transplant. 24 (2), 437-447 (2009).
- Dallas, P. B., et al. Gene expression levels assessed by oligonucleotide microarray analysis and quantitative real-time RT-PCR — how well do they correlate?. BMC Genomics. 6, 59 (2005).
- Rockett, J. C., Hellmann, G. M. Confirming microarray data–is it really necessary?. Genomics. 83 (4), 541-549 (2004).
