Обнаружение экспрессии микроРНК в перитонеальной мембране крыс с использованием количественной ПЦР в реальном времени
Summary
Здесь мы представляем протокол для обнаружения экспрессии микроРНК в перитонеальной мембране крысы с использованием количественной цепной реакции обратной транскрипции в реальном времени. Этот метод подходит для изучения профиля экспрессии микроРНК в перитонеальной мембране крысы в нескольких патологических состояниях.
Abstract
МикроРНК (miRNAs) представляют собой небольшие некодирующие РНК, которые регулируют экспрессию РНК-посланников после транскрипции. Профиль экспрессии miRNA был исследован в различных органах и тканях крысы. Однако стандартные методы очистки miRNAs и обнаружения их экспрессии в крысиной перитонеальной мембране не были установлены. Мы разработали эффективный и надежный метод очистки и количественной оценки miRNAs с использованием количественной реакции обратной транскрипционной полимеразной цепной реакции в реальном времени (qRT-PCR) в перитонеальной мембране крысы. Этот протокол состоит из четырех этапов: 1) очистка образца перитонеальной мембраны; 2) очистка полной РНК, включая miRNA от образца брюшной мембраны; 3) обратная транскрипция miRNA для получения кДНК; И 4) qRT-PCR для определения экспрессии miRNA. Используя этот протокол, мы успешно определили, что экспрессия шести miRNAs (miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327 и miRNA-34a-5p) увеличиласьЗначительно в перитонеальной мембране модели крысиного перитонеального фиброза по сравнению с таковой в контрольных группах. Этот протокол можно использовать для изучения профиля экспрессии miRNA в перитонеальной мембране крыс во многих патологических состояниях.
Introduction
МикроРНК (miRNAs) представляют собой короткие, некодирующие РНК, которые посттранскрипционно регулируют экспрессию РНК (мРНК) мессенджера 1 . Изменения экспрессии miRNAs регулируют экспрессию многих мРНК, которые играют ключевую роль в различных патологических состояниях, включая рак, воспаление, нарушения обмена веществ и фиброз 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 . Таким образом, miRNAs обладают потенциалом в качестве новых биомаркеров и терапевтических мишеней 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 . Профиль экспрессии miRNA был определен у разных крысОрганов и тканей, включая печень, сердце, легкие и почки 9 . Однако стандартные методы очистки и обнаружения miRNAs в перитонеальной мембране крысы не были установлены.
Общая цель этого протокола заключается в успешной очистке и обнаружении miRNAs в перитонеальной мембране крысы. Во-первых, образец перитонеальной мембраны гомогенизировали с использованием стеклянного гомогенизатора с последующим воздействием системы измельчения биополимера в колонку 10 микроцентрифужного спирта. Затем общую РНК, включая miRNA, очищали из образца перитонеальной мембраны с использованием спиновой колонки 10 на основе диоксида кремния. Затем кДНК синтезировали из очищенной полной РНК с использованием обратной транскриптазы, поли (А) полимеразы и олиго-dT-праймера 11 . Наконец, экспрессию miRNA определяли с помощью qRT-PCR с использованием интеркалирующего красителя 11 . Обоснованием этого протокола является bСогласно предыдущим исследованиям, которые показали значительную очистку и обнаружение miRNA в тканях простым процессом 8 , 10 , 11 . Сообщается, что использование системы измельчения биополимера в спин-колонке с микроцентрифугой и спиновой колонке на основе диоксида кремния может очищать высококачественную общую РНК из тканей 10 . Сообщалось, что способ синтеза кДНК из очищенной полной РНК с использованием обратной транскриптазы, поли (А)-полимеразы и олиго-dT-праймера и способ детектирования экспрессии miRNA с помощью qRT-PCR с использованием интеркалирующего красителя в этом протоколе показывают высокую точность и Чувствительность 11 . Кроме того, это простой процесс, который экономит время и предотвращает техническую ошибку. Поэтому этот протокол полезен в исследованиях, которые требуют высокоточного и чувствительного обнаружения miRNA в перитонеальной мембране крысы в широком диапазоне патологических состояний,
Protocol
Representative Results
Discussion
Используя протокол, представленный в этой рукописи, miRNAs в крысиной перитонеальной мембране были успешно очищены и обнаружены с использованием qRT-PCR. Надежность анализа данных qRT-PCR зависит от качества очищенных miRNA. Поэтому чистоту miRNAs можно проверить до qRT-PCR соотношением поглощения при…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Мияко Шигету за отличную техническую поддержку. Эта работа была частично поддержана JSPS KAKENHI (грант № 25461252).
Materials
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | biopolymer-shredding system in a micro centrifuge spin-column |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | silica-membrane based spin column |
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | phenol/guanidine-based lysis reagent |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | wash buffer 1 |
| Buffer RWT | Qiagen | 1067933 | wash buffer 2 |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | includes 10× Nucleics Mix containing deoxynucleotides, ribonucleotide triphosphates, and oligo-dT primers; miScript Reverse Transcriptase Mix containing poly(A) polymerase and reverse transcriptase and; miScript HiSpec buffer |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | includes QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix and miScript Universal Primer |
| RNU6-2 primer | Qiagen | MS00033740 | not disclosed |
| miRNA-142-3p primer | Qiagen | MS00031451 | 5'-UGUAGUGUUUCC UACUUUAUGGA-3' |
| miRNA-21-5p primer | Qiagen | MS00009079 | 5'-UAGCUUAUCAG ACUGAUGUUGA-3' |
| miRNA-221-3p primer | Qiagen | MS00003857 | 5'-AGCUACAUUGU CUGCUGGGUUUC-3' |
| miRNA-223-3p primer | Qiagen | MS00033320 | 5'-UGUCAGUUUG UCAAAUACCCC-3' |
| miRNA-34a-5p primer | Qiagen | MS00003318 | 5'-UGGCAGUGUCU UAGCUGGUUGU-3' |
| miRNA-327 primer | Qiagen | MS00000805 | 5'-CCUUGAGGGG CAUGAGGGU-3' |
| MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | adhesive film for 96-well reaction plate |
| QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument |
| QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument software |
| methylglyoxal | Sigma-Aldrich | M0252 | |
| Midperic | Terumo | not assign | peritoneal dialysis fluid |
| Sprague–Dawley rats | SLC | not assign |
References
- Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay. Nat Rev Genet. 11 (9), 597-610 (2010).
- Beermann, J., Piccoli, M. T., Viereck, J., Thum, T. Non-coding RNAs in Development and Disease: Background, Mechanisms, and Therapeutic Approaches. Physiol Rev. 96 (4), 1297-1325 (2016).
- Saikumar, J., Ramachandran, K., Vaidya, V. S. Noninvasive micromarkers. Clin Chem. 60 (9), 1158-1173 (2014).
- Yang, G., Yang, L., Wang, W., Wang, J., Xu, Z. Discovery and validation of extracellular/circulating microRNAs during idiopathic pulmonary fibrosis disease progression. Gene. 562 (1), 138-144 (2015).
- Zhang, T., et al. Circulating miR-126 is a potential biomarker to predict the onset of type 2 diabetes mellitus in susceptible individuals. Biochem Biophys Res Commun. , (2015).
- Zhong, X., et al. miR-21 is a key therapeutic target for renal injury in a mouse model of type 2 diabetes. Diabetologia. 56 (3), 663-674 (2013).
- Wang, J., et al. Downregulation of urinary cell-free microRNA-214 as a diagnostic and prognostic biomarker in bladder cancer. J Surg Oncol. , (2015).
- Morishita, Y., et al. MicroRNA expression profiling in peritoneal fibrosis. Transl Res. 169, 47-66 (2016).
- Minami, K., et al. miRNA expression atlas in male rat. Sci Data. 1, 140005 (2014).
- Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit. Biotechniques. 40 (1), 54-58 (2006).
- Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nat Methods. 11 (8), 809-815 (2014).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Krediet, R. T., Lindholm, B., Rippe, B. Pathophysiology of peritoneal membrane failure. Perit Dial Int. 20, S22-S42 (2000).
- Devuyst, O., Margetts, P. J., Topley, N. The pathophysiology of the peritoneal membrane. J Am Soc Nephrol. 21 (7), 1077-1085 (2010).
- Hirahara, I., Ishibashi, Y., Kaname, S., Kusano, E., Fujita, T. Methylglyoxal induces peritoneal thickening by mesenchymal-like mesothelial cells in rats. Nephrol Dial Transplant. 24 (2), 437-447 (2009).
- Dallas, P. B., et al. Gene expression levels assessed by oligonucleotide microarray analysis and quantitative real-time RT-PCR — how well do they correlate?. BMC Genomics. 6, 59 (2005).
- Rockett, J. C., Hellmann, G. M. Confirming microarray data–is it really necessary?. Genomics. 83 (4), 541-549 (2004).
