Summary
Qui presentiamo un protocollo per la rilevazione dell'espressione di microRNA nella membrana peritoneale del ratto utilizzando la reazione a catena di polimerasi reattiva-trasversale in tempo reale. Questo metodo è adatto allo studio del profilo di espressione di microRNA nella membrana peritoneale del ratto in diverse condizioni patologiche.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) sono piccoli RNA non codificanti che regolano l'espressione di RNA messaggero post-trascrizionale. Il profilo di espressione miRNA è stato studiato in vari organi e tessuti nel ratto. Tuttavia, i metodi standard per la purificazione di miRNA e l'individuazione della loro espressione nella membrana peritoneale del ratto non sono stati ben stabiliti. Abbiamo sviluppato un metodo efficace e affidabile per purificare e quantificare i miRNA utilizzando la reazione a catena di polimerasi a reazione inversa in tempo reale (qRT-PCR) nella membrana peritoneale del ratto. Questo protocollo è costituito da quattro fasi: 1) purificazione del campione di membrana peritoneale; 2) la purificazione di RNA totale incluso miRNA dal campione di membrana peritoneale; 3) trascrizione inversa di miRNA per produrre cDNA; E 4) qRT-PCR per rilevare l'espressione di miRNA. Usando questo protocollo, abbiamo determinato con successo che l'espressione di sei miRNA (miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327 e miRNA-34a-5p)Significativamente nella membrana peritoneale di un modello di fibrosi peritoneale del ratto rispetto a quelli nei gruppi di controllo. Questo protocollo può essere utilizzato per studiare il profilo dell'espressione di miRNA nella membrana peritoneale dei ratti in molte condizioni patologiche.
Introduction
MicroRNAs (miRNAs) sono brevi e non codificanti RNA che regolano post-trascrizionale l'espressione del messaggero RNA (mRNA) 1 . I cambiamenti nell'espressione dei miRNA regolano l'espressione di molti mRNA che svolgono ruoli chiave in varie condizioni patologiche, tra cui il cancro, l'infiammazione, i disturbi metabolici e la fibrosi 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 . Pertanto, i miRNA hanno potenziale come nuovi biomarcatori e target terapeutici 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 . Il profilo di espressione miRNA è stato determinato in vari rattiOrgani e tessuti, compreso il fegato, il cuore, il polmone e il rene 9 . Tuttavia, i metodi standard per la purificazione e la rilevazione di miRNA nella membrana peritoneale del ratto non sono stati ben stabiliti.
L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di purificare e rilevare con successo miRNA nella membrana peritoneale del ratto. In primo luogo, il campione della membrana peritoneale è stato omogeneizzato utilizzando un omogeneizzatore di vetro, seguito dall'esposizione a un sistema di frantumazione biopolimero in una colonna di spin di microcentrifuga 10 . Successivamente, il RNA totale compreso il miRNA è stato purificato dal campione della membrana peritoneale usando una colonna di spin 10 a base di silice-membrane. Successivamente, il cDNA è stato sintetizzato dal RNA totale purificato utilizzando reverse transcriptase, polimerasi di poli (A) e primer oligo-dT 11 . Infine, l'espressione del miRNA è stata determinata da qRT-PCR usando un colorante intercalante 11 . La logica di questo protocollo è bIn precedenti studi che hanno dimostrato una significativa purificazione e rilevazione del miRNA nei tessuti mediante un semplice processo 8 , 10 , 11 . È stato riferito che l'uso di un sistema di frantumazione biopolimero in una colonna di centrifuga a microcentrifuga e colonna di spin a base di silicio-membrana può purificare l'RNA totale di alta qualità dai tessuti 10 . Il metodo di sintetizzare il cDNA da RNA totale purificato utilizzando transcriptasi inversa, polimerasi poli (A) e primer oligo-dT e il metodo di rilevamento dell'espressione di miRNA mediante qRT-PCR usando il colorante intercalante in questo protocollo sono stati riportati per dimostrare un'elevata precisione e Sensibilità 11 . Inoltre, questo è un processo semplice, che consente di risparmiare tempo e di evitare errori tecnici. Pertanto, questo protocollo è utile in studi che richiedono una rilevazione altamente accurata e sensibile del miRNA nella membrana peritoneale del ratto in una vasta gamma di condizioni patologiche.
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Protocol
Tutti i protocolli sperimentali animali sono stati approvati dal comitato di etica degli animali dell'Università di Jichi Medical e sono stati eseguiti in conformità con le linee guida per l'uso e la cura degli animali sperimentali della Jichi Medical University Guide for Animals Laboratory.
1. Raccolta di campioni peritoneali
- Raccogliere i seguenti elementi: tubo centrifuga da 50 ml con cotone inzuppato in isoflurano, foglio di sughero, piatto di Petri con soluzione salina fosfatica (PBS), forbici chirurgiche e pinze.
- Eutanizzare un ratto con un sovradosaggio di isofluorano, poi spruzzare la pelle addominale del ratto con il 70% di etanolo e montare il ratto sul foglio di sughero sulla schiena.
- Fai un'incisione longitudinale nella pelle addominale, nel muscolo e nella membrana peritoneale usando le forbici e le pinze.
- Prendete la membrana peritoneale usando le pinze e facendo incisioni orizzontali sulla sua porzione superiore lungo l'osso della nervatura inferiore sotto il diaframma e sulla sua lLato laterale sulla zona laterale utilizzando le forbici chirurgiche. Quindi, fare incisioni laterali longitudinali per rimuovere la membrana peritoneale dal corpo usando le forbici chirurgiche. Quindi lavare con PBS in un piatto di Petri.
- Tagliare e tagliare 20 mg (3-5 mm 2 ) di campioni di membrana peritoneale, che è una dimensione adatta per le seguenti fasi, utilizzando le forbici chirurgiche e le pinze.
2. RNA totale purificante da campioni per membrana peritoneale
NOTA: Qui, i campioni di membrana peritoneale di peso 20 mg sono omogeneizzati utilizzando un omogeneizzatore di vetro e un sistema di frantumazione biopolimero in una colonna di centrifuga a microcentrifuga. Quindi, l'RNA totale del campione per la membrana peritoneale viene isolato usando una colonna di spin a base di silice-membrana.
- Raccogliere i seguenti elementi: tubi di microcentrifuga da 1,5 o 2,0 mL, etanolo al 100%, cloroformio, omogeneizzatore di vetro, ghiaccio, sistema di frantumazione biopolimero in una colonna di centrifuga a microcentrifuga 10 10 a base di silice-membrana, reagente di lisi a base di fenolo / guanidina, tampone di lavaggio compreso guanidina ed etanolo (tampone di lavaggio 1) e tampone di lavaggio compreso etanolo (tampone di lavaggio 2).
- Mettere un campione di membrana peritoneale da 20 mg in un omogeneizzatore di vetro e aggiungere 700 μl del reagente di lisi a base di fenolo / guanidina.
- Homogenizzare il campione della membrana peritoneale premendo lentamente il pestello sul campione con torsione. Ripetere questo processo diverse dozzine di volte sul ghiaccio fino a che il campione della membrana peritoneale non sia completamente sciolto nel reagente di lisi a base di fenolo / guanidina.
- Per un'ulteriore omogeneizzazione, trasferire il lisato omogeneizzato al sistema di frantumazione biopolimero in una colonna di centrifuga a microcentrifuga in un tubo di raccolta da 2,0 mL. Quindi, centrifugare a 14.000 xg per 3 minuti a 4 ° C.
- Trasferire il lisato omogeneizzato in un nuovo tubo di microcentrifuga.
- Aggiungere 140 μl di cloroformio al lisato omogeneizzato e coprire la vascaE in modo sicuro. Quindi mescolare il tubo per inversione per 15 s.
- Incubare i campioni per 2-3 minuti a temperatura ambiente. Quindi, centrifugare a 12.000 xg per 15 minuti a 4 ° C.
- Trasferire il surnatante (di solito 300 μL) in un nuovo tubo di microcentrifuga senza disturbare il precipitato e aggiungere 1,5 volte il suo volume (di solito 450 μL) di etanolo al 100%. Quindi mescolare il campione vorticando per 5 s.
- Pipettare fino a 700 μL del campione in una colonna di rotazione a base di silice-membrana posta in un tubo di raccolta da 2,0 ml. Chiudere il tappo della colonna. Quindi, centrifugare a 15.000 xg per 15 s. Dopo la centrifugazione, scartare il flusso nel tubo di raccolta.
- Aggiungere 700 μL di tampone di lavaggio 1 alla colonna di rotazione a base di silice-membrana per lavare strettamente il campione. Chiudere il tappo della colonna. Quindi, centrifugare a 15.000 xg per 15 s. Dopo la centrifugazione, scartare il flusso nel tubo di raccolta.
- Aggiungere 500 μl di tampone di lavaggio 2 al silice-membColonna di rotazione a base di rane per rimuovere qualsiasi traccia di sale. Chiudere il tappo della colonna. Quindi, centrifugare a 15.000 xg per 15 s. Dopo la centrifugazione, scartare il flusso nel tubo di raccolta.
- Ripeti 2.11.
- Centrifugare nuovamente la colonna di spin a base di silice-membrana a 15.000 xg per 1 min. Dopo la centrifugazione, scartare il flusso nel tubo di raccolta.
- Posizionare la colonna di spin a base di silice-membrana in un nuovo tubo di raccolta da 1,5 ml. Quindi, trasferire nella colonna 25 μL di acqua RNasi-libera. Chiudere il tappo della colonna. Lasciare il campione a temperatura ambiente per 5 min. Quindi, centrifugare a 15.000 xg per 1 min.
- Trasferire il 25 μL di eluato contenente RNA totale in un nuovo tubo di microcentrifuga. Quindi, conservarlo a -80 ° C prima dell'uso.
3. Trascrizione inversa di RNA totale
NOTA: Riferimento e adesione alle informazioni minime per la pubblicazione di quantitativi PCR Exper in tempo reale(MIQE) favoriscono una migliore prassi e contribuiscono a ottenere risultati affidabili e inequivocabili 12 .
NOTA: qui un totale di 1,0 μg di RNA isolato viene trascrizione trasversale utilizzando la reversa transcriptasi, polimerasi di poli (A) e primer oligo-dT.
- Raccogliere i seguenti elementi: tubi da 1,5 ml di microcentrifuga; Tubi a nastro a otto pozzetti; Acqua senza RNasi; ghiaccio; Kit di trascrizione trasversale (vedi tabella dei materiali) 11 .
- Preparare una soluzione di master mix contenente 2,0 μL di miscela di acido nucleico 10 volte, 2,0 μL di miscela di reversi transcriptasi (dal kit) e 4,0 μl di 5x hi-spec buffer per un totale di 8,0 μL per tubo.
- Dispensare 8,0 μL di soluzione master mix (dal kit) in ogni tubo.
- Misurare la quantità di RNA totale usando uno spettrofotometro. Aggiungere 1,0 μg di RNA totali isolati purificati dal campione di membrana peritoneale ad ogni tubo.
NOTA: qRT-PCR può essere eseguito usiNg totale RNA come template senza trascrizione inversa per il controllo della qualità dei RNA totali purificati. Se un DNA è contaminato, i prodotti di amplificazione inaspettati vengono osservati da qRT-PCR. - Aggiungere acqua senza RNasi ad ogni tubo per un totale di 20 μL. Quindi, mescolare accuratamente pipettando e centrifugarlo per 15 s.
- Incubare i campioni per 60 minuti a 37 ° C. Immediatamente incubare per 5 minuti a 95 ° C.
NOTA: questo passaggio può essere eseguito in un ciclo termico. - Trasferire il cDNA in un nuovo tubo di microcentrifuga e diluire dieci volte (1:10) con acqua senza RNasi.
- Conservare temporaneamente il cDNA diluito sul ghiaccio e a -80 ° C per lungo tempo prima dell'uso.
4. qRT-PCR di miRNA
NOTA: qRT-PCR di miRNA viene eseguita usando il colorante intercalante. Qui, i primers per RNA, U6 piccoli nuclei 2 (RNU6-2), miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327 e miRNA-34a-5p erano abituati.
- Raccogliere i seguenti elementi: tubi di microcentrifuga da 1,5 ml, piastra di reazione a 96 pozzetti per qRT-PCR, pellicola adesiva per la piastra di reazione a 96 pozzetti, primer specifici miRNA, kit PCR a base di coloranti verdi (vedi tabella dei materiali) 11 e Strumento in tempo reale PCR.
- Preparare un master mix contenente 12,5 μL di 2x master mix PCR, 2,5 μL di 5 μM ciascun primer miRNA disciolto in acqua priva di nucleasi e 1,25 μL di primer universale 10x per ogni pozzetto.
- Dispensare 22,5 μL di master mix in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti.
- Aggiungere 2,5 μL di cDNA di template a ciascun pozzetto.
- Sigillare la piastra con pellicola adesiva per la piastra di reazione a 96 pozzetti. Quindi, centrifugare la piastra a 1.000 xg per 30 s.
- Eseguire il programma di ciclo PCR con lo strumento PCR in tempo reale e il software come segue.
- Impostare la piastra nello strumento PCR in tempo reale. Nel software PCR in tempo reale, definire le proprietà sperimentali (input experimentalScegliere "96 pozzetti" per il tipo sperimentale dello strumento, scegliere "metodo 2 - ΔΔCT " per il metodo di quantitazione, scegliere "reagenti verde SYBR" per il reagente per rilevare la sequenza di destinazione, scegliere "velocità di rampa standard" per Strumento eseguito).
- Quindi, assegnare nomi ai campioni e target miRNA in ogni pozzetto. I campioni vengono sempre testati in duplice o triplicato per ottenere dati sufficienti per la convalida dei risultati. Selezionare il campione di riferimento e il controllo endogeno. Selezionare "none" per utilizzare il colorante come riferimento passivo.
- Immettere un volume di reazione di "20 μL" e le seguenti condizioni di ciclo di PCR nel software PCR in tempo reale secondo le istruzioni: preincubazione a 95 ° C per 15 minuti e successivamente 40 cicli di denaturazione a 94 ° C per 15 s , Ricottura a 55 ° C per 30 s, estensione a 70 ° C per 30 s.
- Analizzare i dati qRT-PCR uCantare il software dello strumento PCR in tempo reale. Verificare che la soglia e la linea di base determinati automaticamente dal software siano appropriati in ciascun pozzetto.
- Controllare il ciclo di soglia dei miRNA target in ciascun campione. Il ciclo di soglia è l'intersezione tra una curva di amplificazione e una linea di soglia. Quindi, normalizzare il livello di espressione dei miRNA target contro RNU6-2 come un controllo endogeno e calcolare il livello di espressione relativa dei miRNA target utilizzando il metodo 2 - ΔΔCT 13 .
NOTA: Si deve osservare che la stabilità del livello di espressione del miRNA di controllo endogeno deve essere verificata. In questo esperimento, RNU6-2 è stato confermato di essere espresso ad alto livello e relativamente invariato in ogni gruppo.
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Representative Results
I risultati qui presentati sono basati sul nostro studio precedentemente riportato 8 . Abbiamo studiato il profilo di espressione miRNA nella fibrosi peritoneale. La fibrosi peritoneale è una delle principali complicanze della dialisi peritoneale. È caratterizzato dalla perdita del monostrato di cellule mesoteliali e dall'accumulo in eccesso di componenti della matrice extracellulare ed è associato all'insuccesso della membrana peritoneale 14 , 15 . Un modello di ratto di fibrosi peritoneale è stato prodotto dall'iniezione intraperitoneale di 100 ml / kg di liquido peritoneale di dialisi (2,5% di glucosio, 100 mM NaCl, 35 mM sodio lattato, 2 mM CaCl2 e 0,7 mM MgCl2 contenente 20 mM metilglyoxal) per 5 Giorni alla settimana per 3 settimane ai ratti maschi, di 12 settimane e con pesi corporei di 230-250 g 16 . I seguenti gruppi servivano come controlli: ratti senza alcun trattamento (ratto maculato) e ratti iniettatiCon liquido di dialisi peritoneale senza metilglyoxal (ratti di controllo). Sulla base dello screening microarray miRNA, abbiamo scoperto che i livelli di sei miRNAs (miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327 e miRNA-34a-5p) Significativamente aumentato nella membrana peritoneale dei ratti della fibrosi peritoneale rispetto a quelli nei ratti macchiati e nei ratti di controllo, utilizzando qRT-PCR seguendo il protocollo presentato in questo manoscritto ( Figura 1 ) 8 .
Figura 1: MiRNA regolati nella membrana peritoneale dei ratti di fibrosi peritoneale. Determinazione di qRT-PCR dell'espressione di miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327 e miRNA-34a-5p nei ratti minacciati (n = 6) , I ratti di controllo (n = 6) e i ratti della fibrosi peritoneale (n = 6). I valori sono l'errore medio ± standard (barre di errore). Analisi della varianza(ANOVA) è stato impiegato per indagare le differenze tra i gruppi. Se la rilevazione statistica è stata rilevata da ANOVA, il test di Tukey è stato eseguito come un'analisi post hoc per confrontare i mezzi di due diversi gruppi. Le differenze con un valore p <0,05 sono state considerate significative. Abbreviazioni: qRT-PCR, reazione a catena quantitativa di reazione-trascrizione polimerasi in tempo reale; MiRNAs, microRNAs; NS, non significativo; *, P <0,05. Questa cifra è stata modificata da Morishita et al. 8 (con autorizzazione). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Utilizzando il protocollo presentato in questo manoscritto, miRNAs nella membrana peritoneale del ratto sono state correttamente purificate e rilevate usando qRT-PCR. L'affidabilità dell'analisi dei dati qRT-PCR dipende dalla qualità dei miRNA purificati. Pertanto, la purezza dei miRNAs può essere controllata prima di qRT-PCR dal rapporto di assorbanza a 260 nm a quella a 280 nm, che può essere misurato usando uno spettrofotometro. Quando non si può ottenere amplificazione significativa di miRNA utilizzando qRT-PCR, la concentrazione del cDNA di template può essere aumentata. La concentrazione di ogni primer specifico per miRNA può anche essere aumentata.
Esistono diversi metodi alternativi per determinare il livello di espressione di miRNA, incluso il microarray, il blotting Northern e il test di protezione della ribonucleasi. QRT-PCR è una procedura sensibile e ad alto rendimento che richiede una quantità minima di campioni rispetto a un test di protezione della proteina di Northern blotting o di ribonucleasi. Le microarray permettono di esaminare l'espRessione di numerosi miRNA simultaneamente e i dati mostrano generalmente una forte correlazione con i dati ottenuti da qRT-PCR 17 ; Tuttavia, non è stato raggiunto alcun consenso in merito a una metodologia che possa confermare la validità dei confronti dei dati di microarray tra gruppi di ricerca 18 .
Questo protocollo ha le seguenti limitazioni. In primo luogo, la convalida del riconoscimento miRNA da questo protocollo non è stata verificata in altri organi come il fegato, il polmone e il rene. In secondo luogo, non è stato ancora verificato in altri animali sperimentali, tra cui mouse, criceto, cane e maiale. La piattaforma di questo protocollo per la purificazione di miRNAs usando una colonna di spin di trionfamento biopolimero e una colonna di spin a base di silice-membrana e la rilevazione di miRNAs usando qRT-PCR è stato riportato di essere in grado di purificare RNA di alta qualità dai tessuti e Mostra elevata precisione e sensibilità per la rilevazione dell'espressione miRNA 10, 11 . Abbiamo anche dimostrato che la rilevazione dell'espressione di miRNA nella membrana peritoneale del ratto può essere condotta con successo utilizzando questo protocollo. Questo protocollo può essere utilizzato per studiare il profilo dell'espressione di miRNA nella membrana peritoneale dei ratti in una vasta gamma di condizioni patologiche. Inoltre, molti campioni possono essere trattati insieme utilizzando questo protocollo perché coinvolge un processo semplice. Pertanto, questo protocollo è utile per studi che richiedono l'analisi del profilo di espressione di molti miRNA in varie condizioni patologiche della membrana peritoneale.
Diversi punti critici devono essere tenuti in mente quando seguono questo protocollo. Innanzitutto, i campioni contenenti RNA purificati devono essere posizionati sul ghiaccio per evitare il degrado. Inoltre, il passaggio di omogeneizzazione dovrebbe essere eseguito su ghiaccio per proteggere gli RNA dal degrado del calore. Inoltre, i campioni di membrana peritoneale dovrebbero essere opportunamente omogeneizzati finché non hanno coCompletamente sciolto in reagente di lisi e si consiglia l'uso di un trituratore di colonna per l'ulteriore omogeneizzazione, perché i campioni pertoneali di membrana contengono un tessuto connettivo sostanziale che è resistente alla dissoluzione mediante omogeneizzazione. In secondo luogo, la stabilità del livello di espressione del miRNA endogeno di controllo dovrebbe essere verificata attraverso la configurazione sperimentale in qRT-PCR. Ciò è necessario perché diverse condizioni patologiche in cui questa procedura può essere utilizzata possono influenzare i livelli di espressione dei miRNA endogeni di controllo, che possono compromettere i risultati.
In conclusione, abbiamo descritto un protocollo per la purificazione e la rilevazione dell'espressione di microRNA nella membrana peritoneale del ratto usando qRT-PCR.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare Miyako Shigeta per il suo ottimo supporto tecnico. Questo lavoro è stato parzialmente supportato da JSPS KAKENHI (numero di sovvenzione 25461252).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | biopolymer-shredding system in a micro centrifuge spin-column |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | silica-membrane based spin column |
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | phenol/guanidine-based lysis reagent |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | wash buffer 1 |
| Buffer RWT | Qiagen | 1067933 | wash buffer 2 |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | includes 10× Nucleics Mix containing deoxynucleotides, ribonucleotide triphosphates, and oligo-dT primers; miScript Reverse Transcriptase Mix containing poly(A) polymerase and reverse transcriptase and; miScript HiSpec buffer |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | includes QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix and miScript Universal Primer |
| RNU6-2 primer | Qiagen | MS00033740 | not disclosed |
| miRNA-142-3p primer | Qiagen | MS00031451 | 5'-UGUAGUGUUUCC UACUUUAUGGA-3' |
| miRNA-21-5p primer | Qiagen | MS00009079 | 5'-UAGCUUAUCAG ACUGAUGUUGA-3' |
| miRNA-221-3p primer | Qiagen | MS00003857 | 5'-AGCUACAUUGU CUGCUGGGUUUC-3' |
| miRNA-223-3p primer | Qiagen | MS00033320 | 5'-UGUCAGUUUG UCAAAUACCCC-3' |
| miRNA-34a-5p primer | Qiagen | MS00003318 | 5'-UGGCAGUGUCU UAGCUGGUUGU-3' |
| miRNA-327 primer | Qiagen | MS00000805 | 5'-CCUUGAGGGG CAUGAGGGU-3' |
| MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | adhesive film for 96-well reaction plate |
| QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument |
| QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument software |
| methylglyoxal | Sigma-Aldrich | M0252 | |
| Midperic | Terumo | not assign | peritoneal dialysis fluid |
| Sprague–Dawley rats | SLC | not assign |
References
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