Detectie van microRNA-expressie in peritoneale membraan van ratten met behulp van kwantitatieve real-time PCR
Summary
Hier presenteren we een protocol voor de detectie van microRNA expressie in het peritoneale membraan van de ratten met behulp van kwantitatieve real-time reverse-transcriptie-polymerase kettingreactie. Deze methode is geschikt voor het bestuderen van het microRNA-expressieprofiel in het peritoneale membraan in verschillende pathologische omstandigheden.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) zijn kleine niet-coderende RNA's die post-transcriptie van messenger RNA regelen. Het miRNA expressieprofiel is onderzocht in verschillende organen en weefsels in rat. Standaardmethoden voor de zuivering van miRNA's en detectie van hun expressie in het peritoneale membraan van de rat zijn echter niet goed vastgesteld. We hebben een effectieve en betrouwbare methode ontwikkeld om miRNA's te zuiveren en kwantificeren met behulp van kwantitatieve real-time reverse-transcriptie-polymerase kettingreactie (qRT-PCR) in het peritoneale membraan van de rat. Dit protocol bestaat uit vier stappen: 1) zuivering van het peritoneale membraan monster; 2) zuivering van totaal RNA inclusief miRNA uit peritoneale membraanmonster; 3) reverse transcriptie van miRNA om cDNA te produceren; En 4) qRT-PCR om miRNA expressie te detecteren. Met behulp van dit protocol, hebben we met succes vastgesteld dat de expressie van zes miRNA's (miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327 en miRNA-34a-5p) toegenomenSignificant in het peritoneale membraan van een rat peritoneale fibrose model vergeleken met die in controle groepen. Dit protocol kan gebruikt worden om het profiel van miRNA expressie in het peritoneale membraan van ratten te onderzoeken in veel pathologische omstandigheden.
Introduction
MicroRNA's (miRNAs) zijn korte, niet-coderende RNA's die expressie-expressie op messenger RNA (mRNA) expressie 1 regelen. Veranderingen in de expressie van miRNAs regelen de expressie van veel mRNAs die pivotale rollen spelen in verschillende pathologische aandoeningen, waaronder kanker, ontsteking, metabolische aandoeningen en fibrose 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 . Daarom hebben miRNAs potentieel als nieuwe biomarkers en therapeutische doelen 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 . Het miRNA expressieprofiel is bepaald in verschillende ratOrganen en weefsels, waaronder lever, hart, long en nier 9 . Echter, standaardmethoden voor de zuivering en detectie van miRNA's in het peritoneale membraan van de rat zijn niet goed vastgesteld.
Het algemene doel van dit protocol is om miRNAs succesvol te zuiveren en te detecteren in het peritoneale membraan van de rat. Ten eerste werd het peritoneale membraanmonster gehomogeniseerd onder gebruikmaking van een glashomogenisator, gevolgd door blootstelling aan een biopolymeer-versnippersysteem in een microcentrifuge spin kolom 10 . Vervolgens werd het totale RNA inclusief miRNA gezuiverd uit het peritoneale membraanmonster onder gebruikmaking van een spin-kolom 10 op siliciumdioxide-membraan. Vervolgens werd cDNA gesynthetiseerd uit het gezuiverde totale RNA onder toepassing van reverse transcriptase, poly (A) polymerase en oligo-dT primer 11 . Tenslotte werd de expressie van miRNA bepaald door qRT-PCR onder gebruikmaking van een intercalerende kleurstof 11 . De reden voor dit protocol is bZoals bij eerdere studies die significante zuivering en detectie van miRNA in weefsels aantoonden door een simpel proces 8 , 10 , 11 . Er is gemeld dat het gebruik van een biopolymeer-versnippersysteem in een microcentrifuge-spinkolom en siliciumdioxide-membraan-gebaseerde spinkolom het totale RNA van hoogwaardig RNA van weefsels 10 kan zuiveren. De werkwijze voor het synthetiseren van cDNA uit gezuiverd totaal RNA onder toepassing van omgekeerde transcriptase, poly (A) polymerase en oligo-dT primer, en de methode om miRNA expressie te detecteren door qRT-PCR onder gebruikmaking van intercalerende kleurstof in dit protocol is aangetoond dat ze hoge nauwkeurigheid en Gevoeligheid 11 . Bovendien is dit een eenvoudig proces, wat tijd bespaart en technische fout voorkomt. Daarom is dit protocol nuttig in studies die zeer nauwkeurige en gevoelige detectie van miRNA in het peritoneale membraan in een breed scala aan pathologische omstandigheden vereisen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Met behulp van het protocol dat in dit manuscript wordt gepresenteerd, werden miRNAs in het peritoneale membraan van de ratten succesvol gezuiverd en gedetecteerd met behulp van qRT-PCR. De betrouwbaarheid van qRT-PCR data analyse hangt af van de kwaliteit van gezuiverde miRNAs. Daarom kan de zuiverheid van miRNA's worden gecontroleerd vóór qRT-PCR door de verhouding van absorptie bij 260 nm tot die bij 280 nm, die kan worden gemeten met behulp van een spectrofotometer. Wanneer significante amplificatie van miRNA …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Miyako Shigeta voor haar uitstekende technische ondersteuning. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door JSPS KAKENHI (subsidie nummer 25461252).
Materials
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | biopolymer-shredding system in a micro centrifuge spin-column |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | silica-membrane based spin column |
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | phenol/guanidine-based lysis reagent |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | wash buffer 1 |
| Buffer RWT | Qiagen | 1067933 | wash buffer 2 |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | includes 10× Nucleics Mix containing deoxynucleotides, ribonucleotide triphosphates, and oligo-dT primers; miScript Reverse Transcriptase Mix containing poly(A) polymerase and reverse transcriptase and; miScript HiSpec buffer |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | includes QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix and miScript Universal Primer |
| RNU6-2 primer | Qiagen | MS00033740 | not disclosed |
| miRNA-142-3p primer | Qiagen | MS00031451 | 5'-UGUAGUGUUUCC UACUUUAUGGA-3' |
| miRNA-21-5p primer | Qiagen | MS00009079 | 5'-UAGCUUAUCAG ACUGAUGUUGA-3' |
| miRNA-221-3p primer | Qiagen | MS00003857 | 5'-AGCUACAUUGU CUGCUGGGUUUC-3' |
| miRNA-223-3p primer | Qiagen | MS00033320 | 5'-UGUCAGUUUG UCAAAUACCCC-3' |
| miRNA-34a-5p primer | Qiagen | MS00003318 | 5'-UGGCAGUGUCU UAGCUGGUUGU-3' |
| miRNA-327 primer | Qiagen | MS00000805 | 5'-CCUUGAGGGG CAUGAGGGU-3' |
| MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | adhesive film for 96-well reaction plate |
| QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument |
| QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument software |
| methylglyoxal | Sigma-Aldrich | M0252 | |
| Midperic | Terumo | not assign | peritoneal dialysis fluid |
| Sprague–Dawley rats | SLC | not assign |
References
- Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay. Nat Rev Genet. 11 (9), 597-610 (2010).
- Beermann, J., Piccoli, M. T., Viereck, J., Thum, T. Non-coding RNAs in Development and Disease: Background, Mechanisms, and Therapeutic Approaches. Physiol Rev. 96 (4), 1297-1325 (2016).
- Saikumar, J., Ramachandran, K., Vaidya, V. S. Noninvasive micromarkers. Clin Chem. 60 (9), 1158-1173 (2014).
- Yang, G., Yang, L., Wang, W., Wang, J., Xu, Z. Discovery and validation of extracellular/circulating microRNAs during idiopathic pulmonary fibrosis disease progression. Gene. 562 (1), 138-144 (2015).
- Zhang, T., et al. Circulating miR-126 is a potential biomarker to predict the onset of type 2 diabetes mellitus in susceptible individuals. Biochem Biophys Res Commun. , (2015).
- Zhong, X., et al. miR-21 is a key therapeutic target for renal injury in a mouse model of type 2 diabetes. Diabetologia. 56 (3), 663-674 (2013).
- Wang, J., et al. Downregulation of urinary cell-free microRNA-214 as a diagnostic and prognostic biomarker in bladder cancer. J Surg Oncol. , (2015).
- Morishita, Y., et al. MicroRNA expression profiling in peritoneal fibrosis. Transl Res. 169, 47-66 (2016).
- Minami, K., et al. miRNA expression atlas in male rat. Sci Data. 1, 140005 (2014).
- Morse, S. M., Shaw, G., Larner, S. F. Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit. Biotechniques. 40 (1), 54-58 (2006).
- Mestdagh, P., et al. Evaluation of quantitative miRNA expression platforms in the microRNA quality control (miRQC) study. Nat Methods. 11 (8), 809-815 (2014).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Krediet, R. T., Lindholm, B., Rippe, B. Pathophysiology of peritoneal membrane failure. Perit Dial Int. 20, S22-S42 (2000).
- Devuyst, O., Margetts, P. J., Topley, N. The pathophysiology of the peritoneal membrane. J Am Soc Nephrol. 21 (7), 1077-1085 (2010).
- Hirahara, I., Ishibashi, Y., Kaname, S., Kusano, E., Fujita, T. Methylglyoxal induces peritoneal thickening by mesenchymal-like mesothelial cells in rats. Nephrol Dial Transplant. 24 (2), 437-447 (2009).
- Dallas, P. B., et al. Gene expression levels assessed by oligonucleotide microarray analysis and quantitative real-time RT-PCR — how well do they correlate?. BMC Genomics. 6, 59 (2005).
- Rockett, J. C., Hellmann, G. M. Confirming microarray data–is it really necessary?. Genomics. 83 (4), 541-549 (2004).
