Nachweis der microRNA-Expression in der peritonealen Membran von Ratten unter Verwendung der quantitativen Echtzeit-PCR
Summary
Hier stellen wir ein Protokoll für den Nachweis der microRNA-Expression in der Ratten-Peritonealmembran unter Verwendung einer quantitativen Echtzeit-Reverse-Transkription-Polymerase-Kettenreaktion vor. Diese Methode eignet sich zur Untersuchung des microRNA-Expressionsprofils in der Ratten-Peritonealmembran in mehreren pathologischen Zuständen.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) sind kleine nicht-kodierende RNAs, die die Messenger-RNA-Expression posttranskriptional regulieren. Das miRNA-Expressionsprofil wurde in verschiedenen Organen und Geweben bei Ratten untersucht. Allerdings sind Standardmethoden für die Reinigung von miRNAs und den Nachweis ihrer Expression in der Ratten-Peritonealmembran nicht gut etabliert. Wir haben eine wirksame und zuverlässige Methode entwickelt, um miRNAs mit quantitativer Echtzeit-Reverse-Transkription Polymerase Kettenreaktion (qRT-PCR) in Ratten-Peritonealmembran zu reinigen und zu quantifizieren. Dieses Protokoll besteht aus vier Schritten: 1) Reinigung der Peritonealmembranprobe; 2) Reinigung der Gesamt-RNA einschließlich miRNA aus der Peritoneal-Membranprobe; 3) reverse Transkription von miRNA zur Erzeugung von cDNA; Und 4) qRT-PCR zur Detektion der miRNA-Expression. Mit diesem Protokoll haben wir erfolgreich festgestellt, dass die Expression von sechs miRNAs (miRNA-142-3p, miRNA-21-5p, miRNA-221-3p, miRNA-223-3p, miRNA-327 und miRNA-34a-5p) zunahmSignifikant in der Peritonealmembran eines Ratten-Peritoneal-Fibrose-Modells im Vergleich zu denen in Kontrollgruppen. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um das Profil der miRNA-Expression in der Peritonealmembran von Ratten in vielen pathologischen Zuständen zu untersuchen.
Introduction
MicroRNAs (miRNAs) sind kurze, nicht-kodierende RNAs, die post-transkriptional die messenger RNA (mRNA) Expression 1 regulieren. Veränderungen in der Expression von miRNAs regulieren die Expression vieler mRNAs, die in verschiedenen pathologischen Zuständen, einschließlich Krebs, Entzündungen, Stoffwechselstörungen und Fibrose, 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , eine zentrale Rolle spielen. Daher haben miRNAs als neuartige Biomarker und therapeutische Ziele 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 Potenzial. Das miRNA-Expressionsprofil wurde in verschiedenen Ratten bestimmtOrgane und Gewebe, einschließlich Leber, Herz, Lunge und Niere 9 . Allerdings sind Standardmethoden zur Reinigung und Detektion von miRNAs in der Ratten-Peritonealmembran nicht gut etabliert.
Das Gesamtziel dieses Protokolls besteht darin, miRNAs in der Ratten-Peritonealmembran erfolgreich zu reinigen und zu detektieren. Zuerst wurde die Peritonealmembranprobe unter Verwendung eines Glashomogenisators homogenisiert, gefolgt von einer Exposition gegenüber einem Biopolymer-Zerkleinerungssystem in einer Mikrozentrifugen-Spinsäule 10 . Als nächstes wurde die Gesamt-RNA, die miRNA enthielt, aus der Peritoneal-Membranprobe unter Verwendung einer Spin-Säule 10 auf Siliciumdioxid-Membran-Basis gereinigt. Dann wurde cDNA aus der gereinigten Gesamt-RNA unter Verwendung von reverser Transkriptase, Poly (A) -Polymerase und Oligo-dT-Primer 11 synthetisiert. Schließlich wurde die Expression von miRNA durch qRT-PCR unter Verwendung eines interkalierenden Farbstoffs 11 bestimmt . Die Begründung dieses Protokolls ist bAuf früheren Studien, die eine signifikante Reinigung und Nachweis von miRNA in Geweben durch ein einfaches Verfahren 8 , 10 , 11 zeigten. Es wurde berichtet, dass die Verwendung eines Biopolymer-Zerkleinerungssystems in einer Mikrozentrifugen-Spinsäule und einer Spin-Säule auf Siliciumdioxid-Membran-Basis eine hochqualitative Gesamt-RNA aus den Geweben 10 reinigen kann. Das Verfahren zur Synthese von cDNA aus gereinigter Gesamt-RNA unter Verwendung von reverser Transkriptase, Poly (A) -Polymerase und Oligo-dT-Primer und das Verfahren zum Nachweis der miRNA-Expression durch qRT-PCR unter Verwendung eines interkalierenden Farbstoffs in diesem Protokoll wurde mit hoher Genauigkeit und einer hohen Genauigkeit beschrieben Empfindlichkeit 11 Darüber hinaus ist dies ein einfacher Prozess, der Zeit spart und technische Fehler verhindert Daher ist dieses Protokoll in Studien nützlich, die einen hochgenauen und empfindlichen Nachweis von miRNA in der Ratten-Peritonealmembran in einem breiten Bereich von pathologischen Zuständen erfordern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Unter Verwendung des in diesem Manuskript dargestellten Protokolls wurden miRNAs in der Ratten-Peritonealmembran erfolgreich gereinigt und unter Verwendung von qRT-PCR nachgewiesen. Die Zuverlässigkeit der qRT-PCR-Datenanalyse hängt von der Qualität der gereinigten miRNAs ab. Daher kann die Reinheit von miRNAs vor der qRT-PCR durch das Verhältnis der Extinktion bei 260 nm zu dem bei 280 nm überprüft werden, was mit einem Spektrophotometer gemessen werden kann. Wenn eine signifikante Amplifikation von miRNA nicht u…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Miyako Shigeta für ihre hervorragende technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde teilweise von JSPS KAKENHI (Grant Nummer 25461252) unterstützt.
Materials
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | biopolymer-shredding system in a micro centrifuge spin-column |
| miRNeasy Mini kit | Qiagen | 217004 | silica-membrane based spin column |
| QIAzol Lysis Reagent | Qiagen | 79306 | phenol/guanidine-based lysis reagent |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | wash buffer 1 |
| Buffer RWT | Qiagen | 1067933 | wash buffer 2 |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | includes 10× Nucleics Mix containing deoxynucleotides, ribonucleotide triphosphates, and oligo-dT primers; miScript Reverse Transcriptase Mix containing poly(A) polymerase and reverse transcriptase and; miScript HiSpec buffer |
| miScript SYBR Green PCR kit | Qiagen | 218073 | includes QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix and miScript Universal Primer |
| RNU6-2 primer | Qiagen | MS00033740 | not disclosed |
| miRNA-142-3p primer | Qiagen | MS00031451 | 5'-UGUAGUGUUUCC UACUUUAUGGA-3' |
| miRNA-21-5p primer | Qiagen | MS00009079 | 5'-UAGCUUAUCAG ACUGAUGUUGA-3' |
| miRNA-221-3p primer | Qiagen | MS00003857 | 5'-AGCUACAUUGU CUGCUGGGUUUC-3' |
| miRNA-223-3p primer | Qiagen | MS00033320 | 5'-UGUCAGUUUG UCAAAUACCCC-3' |
| miRNA-34a-5p primer | Qiagen | MS00003318 | 5'-UGGCAGUGUCU UAGCUGGUUGU-3' |
| miRNA-327 primer | Qiagen | MS00000805 | 5'-CCUUGAGGGG CAUGAGGGU-3' |
| MicroAmp Optical 96 well reaction plate for qRT-PCR | Thermo Fisher Scientific | 4316813 | 96-well reaction plate |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific | 4311971 | adhesive film for 96-well reaction plate |
| QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument |
| QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1. | Thermo Fisher Scientific | 4472380 | real-time PCR instrument software |
| methylglyoxal | Sigma-Aldrich | M0252 | |
| Midperic | Terumo | not assign | peritoneal dialysis fluid |
| Sprague–Dawley rats | SLC | not assign |
References
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