بروتوكولات لتصور الستيرويدي المنشأ أجهزة وهيئات التفاعلية مع المناعية في ذبابة الفاكهة<em> ذبابة الفاكهة</em
Summary
نحن تصف بروتوكول للتشريح، التثبيت، والمناعية من أجهزة الستيرويدي المنشأ في يرقات ذبابة الفاكهة والكبار الإناث لدراسة الستيرويد الحيوي الهرمونات وآلية التنظيمية. بالإضافة إلى أجهزة الستيرويدي المنشأ، ونحن تصور تعصيب أجهزة الستيرويدي المنشأ وكذلك الخلايا المستهدفة الستيرويدي المنشأ مثل الخلايا الجذعية سلالة الجرثومية.
Abstract
في الكائنات متعددة الخلايا، وهبت مجموعة صغيرة من الخلايا مع وظيفة متخصصة في نشاطها الحيوي، الأمر الذي أدى إلى استجابة نظامية للنمو والتكاثر. في الحشرات واليرقات الغدة prothoracic (PG) والكبار الإناث اللعب المبيض أدوار أساسية في biosynthesizing هرمونات الستيرويد الرئيسية دعا ecdysteroids. معصب هذه الأجهزة ecdysteroidogenic من الجهاز العصبي، والتي يتم من خلالها تؤثر على توقيت الحيوي عن طريق الاشارات البيئية. نحن هنا وصف بروتوكول لتصور أجهزة ecdysteroidogenic والأجهزة التفاعلية في اليرقات والكبار من ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة، والتي توفر نظام نموذج مناسب لدراسة هرمون الستيرويد الحيوي والآلية التنظيمية لها. تشريح ماهرا يسمح لنا للحفاظ على مناصب أجهزة ecdysteroidogenic وأعضائهم التفاعلية بما في ذلك الدماغ، الحبل العصبي البطني، والأنسجة الأخرى. المناعية معntibodies ضد الإنزيمات ecdysteroidogenic، جنبا إلى جنب مع البروتينات مضان المعدلة وراثيا يقودها المروجين الأنسجة محددة، وتتوفر لتسمية الخلايا ecdysteroidogenic. وعلاوة على ذلك، فإن innervations الأجهزة ecdysteroidogenic يمكن أيضا أن يكون المسمى من قبل الأجسام المضادة محددة أو مجموعة من السائقين GAL4 في أنواع مختلفة من الخلايا العصبية. ولذلك، فإن أجهزة ecdysteroidogenic وصلاتهم العصبية يمكن تصور في وقت واحد من قبل المناعية والتقنيات المعدلة وراثيا. وأخيرا، نحن تصف كيفية تصور الخلايا الجذعية سلالة الجرثومية، التي انتشار الأسلحة النووية وصيانة تسيطر عليها ecdysteroids. هذه الطريقة تساهم في فهم شامل من الستيرويد الحيوي الهرمونات وآلية تنظيمية العصبية لها.
Introduction
في الكائنات متعددة الخلايا، وهبت مجموعة من الخلايا مع وظيفة متخصصة في نشاطها الحيوي الذي لا غنى عنه للجسم كله. لإنجاز مهامهم، كل النسيج أو العضو يعبر عن سلسلة من الجينات ذات الصلة بمهامهم والتواصل مع الأنسجة الأخرى لتنظيم أنشطتها في سياق التنمية. لتوصيف هذه الوظائف الخلوية المتخصصة والتفاعل بين الأجهزة، ونحن بحاجة إلى تحديد مجموعة من الخلايا جنبا إلى جنب مع إبقائهم أنواع أخرى من الخلايا سليمة في العمارة متعددة الخلايا.
وأحد الأمثلة على هذه الأجهزة المتخصصة هو عضو الستيرويدي المنشأ، حيث تتوسط العديد من الإنزيمات السكروز الخطوات التحويل من الكولسترول لهرمونات الستيرويد نشطة 1. وأعرب معظم هذه الجينات انزيم تحديدا في أجهزة الستيرويدي المنشأ، ويتم تنظيم المسار الحيوي بإحكام من قبل العديد من مؤثرات الخارجية من خلال المدخلات الخلطية والمدخلات العصبية. ذات مرةتفرز توليفها، هرمونات الستيرويد في الدملمف وتستهدف العديد من الأنسجة والأعضاء لتنظيم التعبير عن مجموعة متنوعة من الجينات 2. ولذلك، فإن عمل هرمون منشط يؤدي الى استجابة نظامية للحفاظ على التوازن والنمو والتكاثر.
للتحقيق في وظائف الستيرويد هرمون الحيوي والإجراءات عديد المظاهر من هرمونات الستيرويد، ذبابة الفاكهة يمكن استخدامها كنظام نموذج مناسب. خلال مراحل اليرقات والحشرات هرمون منشط، ecdysteroid، وbiosynthesized في جهاز الغدد الصماء المتخصصة تسمى الغدة prothoracic (PG) 3. في PG، عدة إنزيمات ecdysteroidogenic تحفز على وجه التحديد الخطوات تحويل متعددة من الكولسترول إلى إكديسون، التي تسيطر على طرح الريش والتحول في المراحل التنموية المناسبة 4. لذلك، وينظم تغيير ديناميكية في عيار ecdysteroidمن قبل العديد من مسارات الإشارات في استجابة لمنبهات البيئية. من ناحية أخرى، في مرحلة البلوغ، ecdysteroid يلعب أدوار أساسية في علم وظائف الأعضاء، بما في ذلك الاستنساخ، والنوم، والذاكرة، وعمر 5 و 6 و 7 و 8. ومن المعروف أن ecdysteroid وbiosynthesized بنشاط في المبيض، وتنظيم تطور مراحل تكوين البويضات 6، 7، 8، 9، 10، 11. مؤخرا قمنا ذكرت أن عدد الخلايا الجذعية سلالة الجرثومية (GSCs) يتأثر ecdysteroid والجنس إشارة الببتيد ردا على التزاوج المحفزات 12.
أدوات قوية من D. البطن الوراثة وبيولوجيا الخلايا، بما في ذلك معلومات الجينوم مشروحة بشكل جيد، الجينات ثنائيوقد مكنت أنظمة التعبير، وتقنيات رني المعدلة وراثيا، لنا لتحديد الجينات الضرورية لecdysteroid الحيوي في PG والمبيض 13 و 14 و 15. وبمجرد تحديد الجينات ecdysteroidogenic، وتنظيم النسخي من هذه الجينات وتعريب الديناميكية للمنتجات الجين يمكن فحص في التركيب الحيوي المسار 16. لهذا الغرض، الكمي للعكس النسخ-PCR، وتجرى RNA التهجين في الموقع، وتحليل immunohistological. ويشمل تطبيق هذه التقنيات مهمة صعبة. تشريح مفصل من PG أو المبيض. على وجه الخصوص، PG من ذبابة الفاكهة هو أصغر نسبيا من تلك الحشرات الأخرى (مثل دودة القز ويطير ضربة)، لذلك يحتاج إلى ممارسة مهارة حيوية من ذبابة الفاكهة تشريح لأخذ العينات. وعلاوة على ذلك، تحصل كل من أجهزة ecdysteroidogenic تعصيبالصورة من الجهاز العصبي المركزي (CNS) 17، 18، 19، 20. وهكذا، على التحليلات التشريحية دقيقة، يجب أن تبقى أجهزة ecdysteroidogenic سليمة مع الجهاز العصبي المركزي وغيرها من الأجهزة، وليس لعرقلة صلاتهم العصبية.
هنا نقدم بروتوكولات للتشريح والتصور من أجهزة الستيرويدي المنشأ في D. البطن. تعلم تقنية تشريح هو نقطة الانطلاق الرئيسية لهذه التجارب. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن للمرء أن تسمية بنجاح أجهزة الستيرويدي المنشأ وكذلك أعضائهم تفاعلية مع العديد من الأجسام المضادة وخطوط السائق GAL4. الاستفادة من هذه التقنيات، والمواد، وعلم الوراثة، ويمكن للمرء أن دراسة آليات شاملة من الستيرويد هرمون الحيوي.
Protocol
Representative Results
Discussion
درسنا الحيوي ecdysteroid وآلية تنظيمية في D. البطن، وضعت بروتوكولا للتشريح والمناعية. يتأثر توقيت الحيوي ecdysteroid بواسطة منبهات البيئية من خلال المدخلات العصبية 33، ولذلك فمن الضروري الحفاظ على تعصيب الأجهزة ecdysteroidogenic جنبا إلى جنب مع الدماغ، VNC، والأنسجة ال…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر ريكو كايس وTomotsune Ameku حصول على الدعم الفني من أجل هذا العمل. ونحن ممتنون أيضا للكي إيتو، أولغا أليكسينكو، أكيكو كوتو، ماسايوكي ميورا، مركز الأوراق المالية بلومينغتون ذبابة الفاكهة، مركز اسهم كيوتو (DGRC)، وبنك دراسات الإنمائية هجين للأسهم والكواشف. وأيد هذا العمل عن طريق منح ل YSN من JSPS KAKENHI غرانت عدد 16K20945، ومؤسسة نايتو، وجائزة البحث العلمي اينو. ومنحة لRN من MEXT KAKENHI غرانت عدد 16H04792.
Materials
| egg collection | |||
| tissue culture dish (55 mm) | AS ONE | 1-8549-02 | for grape-juice agar plates |
| collection cup | HIKARI KAGAKU | ||
| yeast paste | Oriental dry yeast, Tokyo | ||
| 100% grape juice | Welch Food Inc. | ||
| rearing larvae | |||
| small vials (12ml, 40×23.5 mm, PS) | SARSTEDT | 58.487 | |
| disposable loop | AS ONE | 6-488-01 | |
| standard fly food | the recepi us on the website of Blooington stock center. | ||
| dissection | |||
| dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | |
| dissecting microscope | Leica | S8 AP0 | |
| tissue culture dish (35 x 10 mm, non-treated) | IWAKI | 1000-035 | |
| Sylgard | TORAY | coarting silicon inside dishes | |
| Terumo needle (27G, 0.40 x 19 mm) | TERUMO | NN-2719S | A "knife" to cut the tissue |
| Terumo syringe, 1ml | TERUMO | SS-01T | |
| forceps, Inox, #5 | Dumont, Switzerland | ||
| insect pin (0.18 mm in diameter) | Shiga Brand | for fillet dissection | |
| micro scissors | NATSUME SEISAKUSHO CO LTD. | MB-50-10 | |
| fixation | |||
| ultrapure water | Merck Millipore | ||
| phosphate buffered saline (PBS) | |||
| Formaldehyde | Nacalai tesque | 16222-65 | |
| Paraformaldehyde | Nacalai tesque | 02890-45 | |
| Triton-X100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| microtubes (1.5 ml) | INA OPTIKA | CF-0150 | |
| Incubation | |||
| As one swist mixer TM-300 (rocker) | As one | TM-300 | rocker |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | 9048-46-8 | |
| primary antibody | |||
| anti-Sro (guinea pig), 1:1000 | |||
| anti-GFP (rabbit), 1:1000 | Molecular Probes | A6455 | Shimada-Niwa ans Niwa, 2014 |
| anti-GFP (mouse mAb, GF200), 1:100 | Nakarai tesque | 04363-66 | |
| anti-5HT (rabbit), 1:500 | SIGMA | S5545 | |
| anti-Hts 1B1 (mouse) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 1B1 | |
| anti-DE-cadherin (rat), 1:20 | DSHB | DCAD2 | |
| anti-nc82 (mouse), 1:50 | DSHB | nc82 | |
| secondary antibody | |||
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-11008 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-11001 | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate | Life Technologies | A-11081 | |
| Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | Life Technologies | A-21435 | |
| Alexa Fluor 546 dye-conjugated phalloidin | Life Technologies | A-22283 | |
| Mounting reagents | |||
| Micro slide glass | Matsunami Glass Ind.,Ltd. | SS7213 | |
| Square microscope cover glass | Matsunami Glass Ind.,Ltd. | C218181 | |
| FluorSave reagent (Mounting reagent) | Calbiochem | 345789 | |
| Transfer pipette 1 ml (Disposable dropper) | WATSON | 5660-222-1S | |
| imaging | |||
| LSM700 laser scanning microscope system | Carl Zeiss | inverted Axio Observer. Z1 SP left | |
| image processing | |||
| LSM700 ZEN | Carl Zeiss | It is a special user interface based on the 64 bit Microsoft Windows7 operating system | |
| ImageJ | |||
| Fly stocks | |||
| w; GMR45C06-GAL4 | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260) | ||
| UAS–GFP; UAS–mCD8::GFP | gifts from K. Ito, The University of Tokyo. | ||
| w[1118] | |||
| w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP | |||
| w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4 | see in Ref29, Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A.(2010) | ||
| w; UAS-mCD8::GFP | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188) | ||
| yw;; nSyb-GAL4 | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941) |
References
- Miller, W. L., Auchus, R. J. The Molecular Biology, Biochemistry, and Physiology of Human Steroidogenesis and Its Disorders. Endocr. Rev. 32 (1), 81-151 (2011).
- Rousseau, G. G. Fifty years ago: The quest for steroid hormone receptors. Mol. Cell. Endocrinol. 375 (1), 10-13 (2013).
- Gilbert, L. I., Rybczynski, R., Warren, J. T. Control and biochemical nature of the ecdysteroidogenic pathway. Annu. Rev. Entomol. 47, 883-916 (2002).
- Niwa, R., Niwa, Y. S. Enzymes for ecdysteroid biosynthesis: their biological functions in insects and beyond. Biosci. Biotechnol. Biochem. 78 (8), 1283-1292 (2014).
- Kozlova, T., Thummel, C. S. Steroid regulation of postembryonic development and reproduction in drosophila. Trends Endocrinol. Metab. 11 (7), 276-280 (2000).
- Ishimoto, H., Kitamoto, T. Beyond molting-roles of the steroid molting hormone ecdysone in regulation of memory and sleep in adult Drosophila. Fly. 5 (3), 215-220 (2011).
- Ishimoto, H., Sakai, T., Kitamoto, T. Ecdysone signaling regulates the formation of long-term courtship memory in adult Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (15), 6381-6386 (2009).
- Simon, A. F., Shih, C., Mack, A., Benzer, S. Steroid control of longevity in Drosophila melanogaster. Science. 299 (5611), 1407-1410 (2003).
- Buszczak, M., Freeman, M. R., Carlson, J. R., Bender, M., Cooley, L., Segraves, W. a Ecdysone response genes govern egg chamber development during mid-oogenesis in Drosophila. Development. 126 (20), 4581-4589 (1999).
- Carney, G. E., Bender, M. The drosophila ecdysone receptor (EcR) gene is required maternally for normal oogenesis. Genetics. 154 (3), 1203-1211 (2000).
- Uryu, O., Ameku, T., Niwa, R. Recent progress in understanding the role of ecdysteroids in adult insects: Germline development and circadian clock in the fruit fly Drosophila melanogaster. Zoological Lett. 1, 32 (2015).
- Ameku, T., Niwa, R. Mating-Induced Increase in Germline Stem Cells via the Neuroendocrine System in Female Drosophila. PLOS Genet. 12 (6), e1006123 (2016).
- Danielsen, E. T., et al. A Drosophila Genome-Wide Screen Identifies Regulators of Steroid Hormone Production and Developmental Timing. Dev. Cell. 37 (6), 558-570 (2016).
- Ou, Q., Zeng, J., Yamanaka, N., Brakken-Thal, C., O’Connor, M. B., King-Jones, K. The Insect Prothoracic Gland as a Model for Steroid Hormone Biosynthesis and Regulation. Cell Rep. , (2016).
- Yamanaka, N., Rewitz, K. F., O’Connor, M. B. Ecdysone control of developmental transitions: lessons from Drosophila research. Annu. Rev. Entomol. 58, 497-516 (2013).
- Niwa, Y. S., Niwa, R. Transcriptional regulation of insect steroid hormone biosynthesis and its role in controlling timing of molting and metamorphosis. Dev. Growth Differ. 58, 94-105 (2015).
- Monastirioti, M. Distinct octopamine cell population residing in the CNS abdominal ganglion controls ovulation in Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 264 (1), 38-49 (2003).
- Siegmund, T., Korge, G. Innervation of the ring gland of Drosophila melanogaster. J. Comp. Neurol. 431 (4), 481-491 (2001).
- McBrayer, Z., et al. Prothoracicotropic Hormone Regulates Developmental Timing and Body Size in Drosophila. Dev. Cell. 13 (6), 857-871 (1979).
- Shimada-Niwa, Y., Niwa, R. Serotonergic neurons respond to nutrients and regulate the timing of steroid hormone biosynthesis in Drosophila. Nat. Commun. 5, 5778 (2014).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bull World Health Organ. 32 (1), 143-144 (1965).
- Abramoff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics Int. 11 (7), 36-42 (2004).
- Ohhara, Y., et al. Autocrine regulation of ecdysone synthesis by β3-octopamine receptor in the prothoracic gland is essential for Drosophila metamorphosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (5), 1452-1457 (2015).
- Gibbens, Y. Y., Warren, J. T., Gilbert, L. I., O’Connor, M. B. Neuroendocrine regulation of Drosophila metamorphosis requires TGFbeta/Activin signaling. Development. 138 (13), 2693-2703 (2011).
- Parvy, J. P., et al. A role for βFTZ-F1 in regulating ecdysteroid titers during post-embryonic development in Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 282 (1), 84-94 (2005).
- Parvy, J. -. P., et al. Forward and feedback regulation of cyclic steroid production in Drosophila melanogaster. Development. 141 (20), 3955-3965 (2014).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Rewitz, K. F., Yamanaka, N., Gilbert, L. I., O’Connor, M. B. The Insect Neuropeptide PTTH Activates Receptor Tyrosine Kinase Torso to Initiate Metamorphosis. Science. 326 (5958), 1403-1405 (2009).
- Li, H. -. H., et al. A GAL4 driver resource for developmental and behavioral studies on the larval CNS of Drosophila. Cell Rep. 8 (3), 897-908 (2014).
- Alekseyenko, O. V., Lee, C., Kravitz, E. A. Targeted manipulation of serotonergic neurotransmission affects the escalation of aggression in adult male Drosophila melanogaster. PLOS One. 5 (5), e10806 (2010).
- Domanitskaya, E., Anllo, L., Schüpbach, T. Phantom, a cytochrome P450 enzyme essential for ecdysone biosynthesis, plays a critical role in the control of border cell migration in in Drosophila. Dev. Biol. 386 (2), 408-418 (2014).
- Song, X., Zhu, C. -. H., Doan, C., Xie, T. Germline stem cells anchored by adherens junctions in the Drosophila ovary niches. Science. 296 (5574), 1855-1857 (2002).
- Niwa, Y. S., Niwa, R. Neural control of steroid hormone biosynthesis during development in the fruit fly Drosophila melanogaster. Genes Genet. Syst. 89 (1), 27-34 (2014).
- Yoshiyama-Yanagawa, T., et al. The conserved Rieske oxygenase DAF-36/Neverland is a novel cholesterol-metabolizing enzyme. J. Biol. Chem. 286 (29), 25756-25762 (2011).
- Niwa, R., et al. Non-molting glossy/shroud encodes a short-chain dehydrogenase/reductase that functions in the "Black Box" of the ecdysteroid biosynthesis pathway. Development. 137 (12), 1991-1999 (2010).
- Komura-Kawa, T., et al. The Drosophila Zinc Finger Transcription Factor Ouija Board Controls Ecdysteroid Biosynthesis through Specific Regulation of spookier. PLOS Genet. 11 (12), e1005712 (2015).
- Yamanaka, N., Marqués, G., O’Connor, M. B. Vesicle-Mediated Steroid Hormone Secretion in Drosophila melanogaster. Cell. 163 (4), 907-919 (2015).
- Riemensperger, T., Pech, U., Dipt, S., Fiala, A. Optical calcium imaging in the nervous system of Drosophila melanogaster. BBA-Gen. Subjects. 1820 (8), 1169-1178 (2012).
- Owald, D., Lin, S., Waddell, S. Light, heat, action: neural control of fruit fly behavior. Phil. T. Roy. Soc. B. 370 (1677), 20140211 (2015).
