Protocolli per la visualizzazione steroidogenica organi e dei loro organi interattivi con Immunocolorazione nella mosca della frutta<em> Drosophila melanogaster</em
Summary
Descriviamo un protocollo per la dissezione, la fissazione, e immunocolorazione di organi steroidogeniche in Drosophila larve e adulti femmine per studiare steroidi biosintesi dell'ormone e del suo meccanismo di regolazione. Oltre agli organi steroidogenici, visualizziamo l'innervazione degli organi steroidogeniche così come cellule bersaglio steroidogeniche come le cellule staminali germinali.
Abstract
Negli organismi multicellulari, un piccolo gruppo di cellule è dotato di una funzione specializzata nella loro attività biogenica, inducendo una risposta sistemica crescita e la riproduzione. Negli insetti, ghiandola larvale prothoracic (PG) e le femmine adulte azione ovaio ruoli essenziali biosynthesizing principali ormoni steroidei chiamati ecdysteroids. Questi organi ecdysteroidogenic sono innervati dal sistema nervoso, attraverso cui la temporizzazione della biosintesi è influenzato da stimoli ambientali. Qui si descrive un protocollo per la visualizzazione degli organi e dei loro organi ecdysteroidogenic interattivi in larve e adulti della mosca della frutta Drosophila melanogaster, che fornisce un sistema modello adatto per lo studio ormone steroide biosintesi e il suo meccanismo di regolazione. dissezione abile permette di mantenere le posizioni degli organi ecdysteroidogenic e dei loro organi interattivi compreso il cervello, il cordone nervoso ventrale, e altri tessuti. Immunocolorazione con unntibodies contro enzimi ecdysteroidogenic, insieme a proteine transgeniche fluorescenza guidati dai promotori tessuto-specifici, sono disponibili per marcare le cellule ecdysteroidogenic. Inoltre, i innervazione degli organi ecdysteroidogenic possono anche essere etichettati da anticorpi specifici o una serie di driver GAL4 in vari tipi di neuroni. Pertanto, gli organi ecdysteroidogenic e le loro connessioni neuronali possono essere visualizzati simultaneamente mediante immunocolorazione e tecniche transgeniche. Infine, si descrive come visualizzare le cellule staminali germinali, la cui proliferazione e manutenzione sono controllate da ecdysteroids. Questo metodo contribuisce alla comprensione globale di steroide biosintesi dell'ormone e del suo meccanismo di regolazione neuronale.
Introduction
Negli organismi multicellulari, un gruppo di celle è dotato di una funzione specializzata nella loro attività biogenica che è essenziale per tutto il corpo. Assolvere i loro compiti, ogni tessuto o organo esprime una serie di geni correlati alle loro funzioni e comunica con altri tessuti orchestrare loro attività nel contesto dello sviluppo. Caratterizzare tali funzioni cellulari specializzate e interazioni tra organi, è necessario specificare un gruppo di celle insieme ad altri tipi di celle essendo mantenuta intatta nell'architettura multicellulare.
Un esempio di tali organi specializzati è un organo steroidea, dove molti enzimi biosintetici mediare le fasi di conversione di colesterolo ad ormoni steroidei attivi 1. La maggior parte di questi geni enzimatici sono specificamente espressi in organi steroidogenici, e via di biosintesi è strettamente regolata da numerosi stimoli esterni tramite ingressi umorali e ingressi neuronali. Una voltasintetizzati, ormoni steroidei sono secreti nel emolinfa e sono mirati a molti tessuti e organi per regolare l'espressione di una varietà di geni 2. Pertanto, l'azione di un ormone steroideo induce una risposta sistemica per mantenere l'omeostasi, la crescita e la riproduzione.
Per studiare le funzioni di steroidi biosintesi dell'ormone e le azioni pleiotropici degli ormoni steroidei, Drosophila melanogaster può essere utilizzato come sistema modello adatto. Durante gli stadi larvali, l'ormone steroide insetto, ecdysteroid, è biosynthesized in un organo endocrino specializzato chiamato ghiandola prothoracic (PG) 3. Nel PG, diversi enzimi catalizzano ecdysteroidogenic specificamente le molteplici fasi di conversione da colesterolo ecdysone, che controlla la muta e metamorfosi in opportuni stadi di sviluppo 4. Pertanto, un cambiamento dinamico nel titolo ecdysteroid è regolatada molte vie di segnalazione in risposta a stimoli ambientali. D'altra parte, nella fase adulta, ecdysteroid svolge ruoli essenziali nella fisiologia, compresa la riproduzione, il sonno, la memoria, e durata della vita 5, 6, 7, 8. E 'noto che ecdysteroid attivamente biosynthesized nell'ovaio, regolando la progressione dell'oogenesi 6, 7, 8, 9, 10, 11. Recentemente abbiamo riportato che il numero di cellule staminali germinali (GSC) è interessato da ecdysteroid e sesso segnalazione peptide in risposta a stimoli di accoppiamento 12.
Potenti strumenti di D. melanogaster genetica e della biologia delle cellule, comprese le informazioni del genoma ben annotato-, gene binariosistemi di espressione, e tecniche transgeniche RNAi, hanno permesso di identificare geni essenziali per ecdysteroid biosintesi del PG e dell'ovaio 13, 14, 15. Una volta che i geni ecdysteroidogenic sono identificati, la regolazione trascrizionale di questi geni e le localizzazioni dinamiche dei prodotti genici può essere esaminata in via di biosintesi 16. A tale scopo, quantitativa-trascrizione inversa-PCR, RNA ibridizzazione in situ, e l'analisi immunoistochimica sono condotte. L'applicazione di queste tecniche comprende un compito impegnativo; l'elaborato dissezione del PG o l'ovaio. In particolare, il PG della mosca della frutta è relativamente inferiore a quella di altri insetti (ad esempio, il baco da seta e la mosca colpo), quindi si ha la necessità di praticare la competenza fondamentale di frutta dissezione mosca per il campionamento. Inoltre, entrambi gli organi ecdysteroidogenic ricevono innervaziones dal sistema nervoso centrale (CNS) 17, 18, 19, 20. Così, per analisi anatomiche accurate, gli organi ecdysteroidogenic dovrebbero restare inalterate con lo SNC e altri organi, non rovinare le loro connessioni neuronali.
Qui forniamo protocolli per la dissezione e la visualizzazione degli organi steroidogeniche in D. melanogaster. Imparare la tecnica di dissezione è il punto di partenza fondamentale per questi esperimenti. Inoltre, si possono etichettare correttamente gli organi steroidogenici così come i loro organi interattivi con numerosi anticorpi e linee conducente GAL4. Approfittando di queste tecniche, materiali e genetica, si possono studiare i meccanismi completi di steroidi biosintesi dell'ormone.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo studiato biosintesi ecdysteroid e il suo meccanismo di regolazione in D. melanogaster, ed ideato un protocollo per la dissezione e immunocolorazione. I tempi di biosintesi ecdysteroid è influenzato da stimoli ambientali attraverso ingressi neuronali 33, quindi è essenziale per mantenere l'innervazione degli organi ecdysteroidogenic insieme al cervello, VNC, e altri tessuti durante la dissezione.
Come descritto sopra, il D. melanogaster …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Reiko Kise e Tomotsune Ameku per il loro supporto tecnico per questo lavoro. Siamo anche grati a Kei Ito, Olga Alekseyenko, Akiko Koto, Masayuki Miura, il Bloomington Drosophila Stock Center, Kyoto Stock Center (DGRC), e il Developmental Studies Ibridoma Banca per le scorte e reagenti. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni a YSN da JSPS KAKENHI Concessione Numero 16K20945, la Fondazione Naito, e il Premio Ricerca Scienza Inoue; e da una sovvenzione alla RN da MEXT KAKENHI Concessione Numero 16H04792.
Materials
| egg collection | |||
| tissue culture dish (55 mm) | AS ONE | 1-8549-02 | for grape-juice agar plates |
| collection cup | HIKARI KAGAKU | ||
| yeast paste | Oriental dry yeast, Tokyo | ||
| 100% grape juice | Welch Food Inc. | ||
| rearing larvae | |||
| small vials (12ml, 40×23.5 mm, PS) | SARSTEDT | 58.487 | |
| disposable loop | AS ONE | 6-488-01 | |
| standard fly food | the recepi us on the website of Blooington stock center. | ||
| dissection | |||
| dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | |
| dissecting microscope | Leica | S8 AP0 | |
| tissue culture dish (35 x 10 mm, non-treated) | IWAKI | 1000-035 | |
| Sylgard | TORAY | coarting silicon inside dishes | |
| Terumo needle (27G, 0.40 x 19 mm) | TERUMO | NN-2719S | A "knife" to cut the tissue |
| Terumo syringe, 1ml | TERUMO | SS-01T | |
| forceps, Inox, #5 | Dumont, Switzerland | ||
| insect pin (0.18 mm in diameter) | Shiga Brand | for fillet dissection | |
| micro scissors | NATSUME SEISAKUSHO CO LTD. | MB-50-10 | |
| fixation | |||
| ultrapure water | Merck Millipore | ||
| phosphate buffered saline (PBS) | |||
| Formaldehyde | Nacalai tesque | 16222-65 | |
| Paraformaldehyde | Nacalai tesque | 02890-45 | |
| Triton-X100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| microtubes (1.5 ml) | INA OPTIKA | CF-0150 | |
| Incubation | |||
| As one swist mixer TM-300 (rocker) | As one | TM-300 | rocker |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | 9048-46-8 | |
| primary antibody | |||
| anti-Sro (guinea pig), 1:1000 | |||
| anti-GFP (rabbit), 1:1000 | Molecular Probes | A6455 | Shimada-Niwa ans Niwa, 2014 |
| anti-GFP (mouse mAb, GF200), 1:100 | Nakarai tesque | 04363-66 | |
| anti-5HT (rabbit), 1:500 | SIGMA | S5545 | |
| anti-Hts 1B1 (mouse) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 1B1 | |
| anti-DE-cadherin (rat), 1:20 | DSHB | DCAD2 | |
| anti-nc82 (mouse), 1:50 | DSHB | nc82 | |
| secondary antibody | |||
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-11008 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-11001 | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate | Life Technologies | A-11081 | |
| Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | Life Technologies | A-21435 | |
| Alexa Fluor 546 dye-conjugated phalloidin | Life Technologies | A-22283 | |
| Mounting reagents | |||
| Micro slide glass | Matsunami Glass Ind.,Ltd. | SS7213 | |
| Square microscope cover glass | Matsunami Glass Ind.,Ltd. | C218181 | |
| FluorSave reagent (Mounting reagent) | Calbiochem | 345789 | |
| Transfer pipette 1 ml (Disposable dropper) | WATSON | 5660-222-1S | |
| imaging | |||
| LSM700 laser scanning microscope system | Carl Zeiss | inverted Axio Observer. Z1 SP left | |
| image processing | |||
| LSM700 ZEN | Carl Zeiss | It is a special user interface based on the 64 bit Microsoft Windows7 operating system | |
| ImageJ | |||
| Fly stocks | |||
| w; GMR45C06-GAL4 | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260) | ||
| UAS–GFP; UAS–mCD8::GFP | gifts from K. Ito, The University of Tokyo. | ||
| w[1118] | |||
| w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP | |||
| w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4 | see in Ref29, Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A.(2010) | ||
| w; UAS-mCD8::GFP | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188) | ||
| yw;; nSyb-GAL4 | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941) |
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