과일 플라이의 면역 염색과 Steroidogenic 기관 및 그들의 상호 작용하는 장기를 시각화하기위한 프로토콜<em> 노랑 초파리</em
Summary
우리는 해부, 고정, 스테로이드 호르몬 생합성과 규제 메커니즘을 연구하는 초파리 유충과 성인 여성의 steroidogenic 장기의 면역 염색을위한 프로토콜을 설명합니다. steroidogenic 기관뿐만 아니라, 우리는 배아 줄기 세포로 steroidogenic 기관의 신경 분포뿐만 아니라 steroidogenic 표적 세포를 시각화.
Abstract
다세포 생물에있어서, 세포의 작은 그룹은 성장과 재생에 대한 조직 반응을 유도하는 그들의 생물학적 활성의 특수한 기능을 부여한다. 곤충, 애벌레 prothoracic 글 랜드 (PG) 및 ecdysteroids라는 주요 스테로이드 호르몬 생합성에있는 성인 여성의 난소 플레이 필수적인 역할. 이러한 기관은 ecdysteroidogenic 생합성 타이밍 큐 환경에 의해 영향을 받는다되는 신경계에서 신경 지배된다. 여기에서 우리는 스테로이드 호르몬 생합성과 규제 메커니즘을 연구하기위한 적절한 모델 시스템을 제공 초파리 melanogaster의를 비행 ecdysteroidogenic 기관과 유충에서의 대화 형 기관과 과일의 성인을 시각화하는 프로토콜을 설명합니다. 숙련 된 해부은 우리가 뇌, 복부 신경 코드 및 다른 조직을 포함하여 ecdysteroidogenic 기관의 위치와 그들의 상호 작용하는 기관을 유지할 수 있습니다. 로모그래퍼 면역 염색ecdysteroidogenic 효소에 대한 ntibodies는 조직 – 특이 적 프로모터에 의해 구동 형질 전환 형광 단백질과 함께 ecdysteroidogenic 세포를 레이블을 사용할 수 있습니다. 또한, ecdysteroidogenic 기관의 신경 밀도는 특정 항체 또는 신경의 여러 유형에 GAL4 드라이버의 집합으로 분류 될 수있다. 따라서 ecdysteroidogenic 기관과 신경 세포의 연결은 면역 염색 및 형질 전환 기술에 의해 동시에 시각화 할 수 있습니다. 마지막으로, 우리는 누구의 증식과 유지 보수 ecdysteroids에 의해 제어되는 배아 줄기 세포를 시각화하는 방법에 대해 설명합니다. 이 방법은 스테로이드 호르몬 생합성과 신경 규제 메커니즘의 포괄적 인 이해에 기여한다.
Introduction
다세포 생물에서는 세포의 그룹은 몸 전체에 필수적인 그들의 생체 활동의 전문 기능을 부여한다. 자신의 임무를 완수하기 위해 각 조직이나 기관의 기능과 관련된 유전자의 일련의 표현과 발전의 맥락에서 자신의 활동을 조율하기 위해 다른 조직과 통신한다. 이러한 전문적인 세포 기능과 간 장기 상호 작용을 특성화하기 위해, 우리는 다른 종류의 세포가 다세포 구조에서 그대로 유지되고 함께 세포의 그룹을 지정해야합니다.
이러한 전문 기관의 한 예는 많은 생합성 효소가 활성화 스테로이드 호르몬 1 콜레스테롤에서 변환 단계를 중재 steroidogenic 기관이다. 이러한 효소 유전자의 대부분은 기관 steroidogenic 구체적으로 표현되고, 생합성 경로 단단히 체액 입력 및 신경 입력을 통해 다수의 외부 자극에 의해 조절된다. 일단합성 스테로이드 호르몬은 체액으로 분비되는 유전자 (2)의 다양한 종류의 발현을 조절하기위한 여러 조직 및 기관을 대상으로한다. 따라서, 스테로이드 호르몬의 작용은 항상성, 성장 및 재생을 유지하기 위해 전신 반응을 유도한다.
스테로이드 호르몬 생합성 기능 및 스테로이드 호르몬의다면 발현 성 행동을 조사, 노랑 초파리은 적합한 모델 시스템으로 사용할 수있다. 애벌레 단계 동안, 곤충 스테로이드 호르몬, ecdysteroid가, 전문 내분비 기관에서 생합성되는 것은 prothoracic 글 랜드 (PG)을 3이라고합니다. PG에서, 여러 ecdysteroidogenic 효소 특히 적절한 발달 단계 4에서 탈피하고 변태 제어하는 에크 디손로 콜레스테롤로부터 여러 전환 단계를 촉매. 따라서 ecdysteroid 역가 동적 변화 규제환경 단서에 따라 많은 신호 전달 경로에 의해. 한편, 성인 단계에서 ecdysteroid은 재생, 수면, 메모리 및 수명 5, 6, 7, 8을 포함하여 생리에 중요한 역할을한다. 이는 적극적 ecdysteroid oogenesis 6, 7, 8, 9, 10, 11의 진행을 조절 난소 생합성하는 것으로 알려져있다. 최근 우리는 배아 줄기 세포 (GSC를)의 개수가 정합에 응답 ecdysteroid 성 펩티드 및 시그널링에 의해 영향을받는 것으로보고 (12)를 자극했다.
D.의 강력한 도구가 잘 주석 게놈 정보를 포함 유전학 및 세포 생물학을, melanogaster의 이진 유전자발현 시스템 및 유전자의 RNAi 기술은 PG 및 난소 13, 14, 15 생합성을 ecdysteroid 필수적인 유전자를 식별 할 수있게했다. ecdysteroidogenic 유전자가 식별되면, 이러한 유전자 및 유전자 산물의 동적 지역화의 전사 조절은 생합성 경로 (16)에 조사 될 수있다. 이를 위해, 정량적 역전사 – 중합 효소 연쇄 반응은 동일계 하이브리드 화 및 면역 조직 RNA 분석을 실시한다. 이러한 기술의 적용은 어려운 과제를 포함하고; PG 또는 난소의 정교한 해부. 특히, 초파리의 PG는 다른 곤충에 비해 상대적으로 작은 (예 : 누에와 타격 비행은), 그래서 하나는 과일의 중요한 기술이 샘플링 해부 비행 연습을 할 필요가있다. 또한, 두 ecdysteroidogenic 기관은 신경 분포를받을중추 신경계 (CNS) 17, 18, 19, 20 S. 따라서, 정확한 해부학 적 분석을 위해 상기 장기 ecdysteroidogenic은 CNS 및 다른 기관들은 신경 연결을 방해하지 함께 그대로 유지한다.
여기에서 우리는 해부와 D의 steroidogenic 기관의 시각화를위한 프로토콜을 제공합니다. melanogaster의. 해부 기술을 배우는 것은이 실험에 대한 중요한 출발점이 될 것입니다. 또한, 하나는 성공적으로 여러 항체 및 GAL4 드라이버 라인으로 steroidogenic 기관뿐만 아니라 상호 작용하는 기관에 레이블을 지정할 수 있습니다. 이러한 기술, 재료 및 유전학을 활용, 하나는 스테로이드 호르몬 생합성의 포괄적 인 메커니즘을 연구 할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 ecdysteroid 생합성 및 D. melanogaster의에서의 규제 메커니즘을 연구하고, 해부 및 면역 염색을위한 프로토콜을 고안했다. ecdysteroid 생합성의 타이밍은 신경 입력 큐 (33)의 환경에 의해 영향을받는, 그래서 박리시 뇌 VNC 및 다른 조직과 함께 ecdysteroidogenic 기관의 신경 분포를 유지하기 위해 필수적이다.
전술 한 바와 같이, D. melanogaster의…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는이 작품에 대한 자신의 기술 지원 레이코 키세 및 Tomotsune Ameku 감사합니다. 우리는 또한 케이 이토, 올가 알렉시앙코, 아키코 고토 마사유키 미우라, 블루밍턴 초파리 증권 센터, 교토 증권 센터 (DGRC)과 주식 및 시약의 발달 연구 하이 브리 도마 은행에 감사하고 있습니다. 이 작품은 JSPS KAKENHI 허가 번호 16K20945, 나이토 재단, 그리고 이노우에 과학 연구 상에서 YSN 보조금에 의해 지원되었다; 및 문부 과학성 KAKENHI 허가 번호 16H04792에서 RN에 그랜트.
Materials
| egg collection | |||
| tissue culture dish (55 mm) | AS ONE | 1-8549-02 | for grape-juice agar plates |
| collection cup | HIKARI KAGAKU | ||
| yeast paste | Oriental dry yeast, Tokyo | ||
| 100% grape juice | Welch Food Inc. | ||
| rearing larvae | |||
| small vials (12ml, 40×23.5 mm, PS) | SARSTEDT | 58.487 | |
| disposable loop | AS ONE | 6-488-01 | |
| standard fly food | the recepi us on the website of Blooington stock center. | ||
| dissection | |||
| dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | |
| dissecting microscope | Leica | S8 AP0 | |
| tissue culture dish (35 x 10 mm, non-treated) | IWAKI | 1000-035 | |
| Sylgard | TORAY | coarting silicon inside dishes | |
| Terumo needle (27G, 0.40 x 19 mm) | TERUMO | NN-2719S | A "knife" to cut the tissue |
| Terumo syringe, 1ml | TERUMO | SS-01T | |
| forceps, Inox, #5 | Dumont, Switzerland | ||
| insect pin (0.18 mm in diameter) | Shiga Brand | for fillet dissection | |
| micro scissors | NATSUME SEISAKUSHO CO LTD. | MB-50-10 | |
| fixation | |||
| ultrapure water | Merck Millipore | ||
| phosphate buffered saline (PBS) | |||
| Formaldehyde | Nacalai tesque | 16222-65 | |
| Paraformaldehyde | Nacalai tesque | 02890-45 | |
| Triton-X100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| microtubes (1.5 ml) | INA OPTIKA | CF-0150 | |
| Incubation | |||
| As one swist mixer TM-300 (rocker) | As one | TM-300 | rocker |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | 9048-46-8 | |
| primary antibody | |||
| anti-Sro (guinea pig), 1:1000 | |||
| anti-GFP (rabbit), 1:1000 | Molecular Probes | A6455 | Shimada-Niwa ans Niwa, 2014 |
| anti-GFP (mouse mAb, GF200), 1:100 | Nakarai tesque | 04363-66 | |
| anti-5HT (rabbit), 1:500 | SIGMA | S5545 | |
| anti-Hts 1B1 (mouse) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 1B1 | |
| anti-DE-cadherin (rat), 1:20 | DSHB | DCAD2 | |
| anti-nc82 (mouse), 1:50 | DSHB | nc82 | |
| secondary antibody | |||
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-11008 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-11001 | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate | Life Technologies | A-11081 | |
| Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | Life Technologies | A-21435 | |
| Alexa Fluor 546 dye-conjugated phalloidin | Life Technologies | A-22283 | |
| Mounting reagents | |||
| Micro slide glass | Matsunami Glass Ind.,Ltd. | SS7213 | |
| Square microscope cover glass | Matsunami Glass Ind.,Ltd. | C218181 | |
| FluorSave reagent (Mounting reagent) | Calbiochem | 345789 | |
| Transfer pipette 1 ml (Disposable dropper) | WATSON | 5660-222-1S | |
| imaging | |||
| LSM700 laser scanning microscope system | Carl Zeiss | inverted Axio Observer. Z1 SP left | |
| image processing | |||
| LSM700 ZEN | Carl Zeiss | It is a special user interface based on the 64 bit Microsoft Windows7 operating system | |
| ImageJ | |||
| Fly stocks | |||
| w; GMR45C06-GAL4 | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260) | ||
| UAS–GFP; UAS–mCD8::GFP | gifts from K. Ito, The University of Tokyo. | ||
| w[1118] | |||
| w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP | |||
| w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4 | see in Ref29, Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A.(2010) | ||
| w; UAS-mCD8::GFP | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188) | ||
| yw;; nSyb-GAL4 | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941) |
References
- Miller, W. L., Auchus, R. J. The Molecular Biology, Biochemistry, and Physiology of Human Steroidogenesis and Its Disorders. Endocr. Rev. 32 (1), 81-151 (2011).
- Rousseau, G. G. Fifty years ago: The quest for steroid hormone receptors. Mol. Cell. Endocrinol. 375 (1), 10-13 (2013).
- Gilbert, L. I., Rybczynski, R., Warren, J. T. Control and biochemical nature of the ecdysteroidogenic pathway. Annu. Rev. Entomol. 47, 883-916 (2002).
- Niwa, R., Niwa, Y. S. Enzymes for ecdysteroid biosynthesis: their biological functions in insects and beyond. Biosci. Biotechnol. Biochem. 78 (8), 1283-1292 (2014).
- Kozlova, T., Thummel, C. S. Steroid regulation of postembryonic development and reproduction in drosophila. Trends Endocrinol. Metab. 11 (7), 276-280 (2000).
- Ishimoto, H., Kitamoto, T. Beyond molting-roles of the steroid molting hormone ecdysone in regulation of memory and sleep in adult Drosophila. Fly. 5 (3), 215-220 (2011).
- Ishimoto, H., Sakai, T., Kitamoto, T. Ecdysone signaling regulates the formation of long-term courtship memory in adult Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (15), 6381-6386 (2009).
- Simon, A. F., Shih, C., Mack, A., Benzer, S. Steroid control of longevity in Drosophila melanogaster. Science. 299 (5611), 1407-1410 (2003).
- Buszczak, M., Freeman, M. R., Carlson, J. R., Bender, M., Cooley, L., Segraves, W. a Ecdysone response genes govern egg chamber development during mid-oogenesis in Drosophila. Development. 126 (20), 4581-4589 (1999).
- Carney, G. E., Bender, M. The drosophila ecdysone receptor (EcR) gene is required maternally for normal oogenesis. Genetics. 154 (3), 1203-1211 (2000).
- Uryu, O., Ameku, T., Niwa, R. Recent progress in understanding the role of ecdysteroids in adult insects: Germline development and circadian clock in the fruit fly Drosophila melanogaster. Zoological Lett. 1, 32 (2015).
- Ameku, T., Niwa, R. Mating-Induced Increase in Germline Stem Cells via the Neuroendocrine System in Female Drosophila. PLOS Genet. 12 (6), e1006123 (2016).
- Danielsen, E. T., et al. A Drosophila Genome-Wide Screen Identifies Regulators of Steroid Hormone Production and Developmental Timing. Dev. Cell. 37 (6), 558-570 (2016).
- Ou, Q., Zeng, J., Yamanaka, N., Brakken-Thal, C., O’Connor, M. B., King-Jones, K. The Insect Prothoracic Gland as a Model for Steroid Hormone Biosynthesis and Regulation. Cell Rep. , (2016).
- Yamanaka, N., Rewitz, K. F., O’Connor, M. B. Ecdysone control of developmental transitions: lessons from Drosophila research. Annu. Rev. Entomol. 58, 497-516 (2013).
- Niwa, Y. S., Niwa, R. Transcriptional regulation of insect steroid hormone biosynthesis and its role in controlling timing of molting and metamorphosis. Dev. Growth Differ. 58, 94-105 (2015).
- Monastirioti, M. Distinct octopamine cell population residing in the CNS abdominal ganglion controls ovulation in Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 264 (1), 38-49 (2003).
- Siegmund, T., Korge, G. Innervation of the ring gland of Drosophila melanogaster. J. Comp. Neurol. 431 (4), 481-491 (2001).
- McBrayer, Z., et al. Prothoracicotropic Hormone Regulates Developmental Timing and Body Size in Drosophila. Dev. Cell. 13 (6), 857-871 (1979).
- Shimada-Niwa, Y., Niwa, R. Serotonergic neurons respond to nutrients and regulate the timing of steroid hormone biosynthesis in Drosophila. Nat. Commun. 5, 5778 (2014).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bull World Health Organ. 32 (1), 143-144 (1965).
- Abramoff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics Int. 11 (7), 36-42 (2004).
- Ohhara, Y., et al. Autocrine regulation of ecdysone synthesis by β3-octopamine receptor in the prothoracic gland is essential for Drosophila metamorphosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (5), 1452-1457 (2015).
- Gibbens, Y. Y., Warren, J. T., Gilbert, L. I., O’Connor, M. B. Neuroendocrine regulation of Drosophila metamorphosis requires TGFbeta/Activin signaling. Development. 138 (13), 2693-2703 (2011).
- Parvy, J. P., et al. A role for βFTZ-F1 in regulating ecdysteroid titers during post-embryonic development in Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 282 (1), 84-94 (2005).
- Parvy, J. -. P., et al. Forward and feedback regulation of cyclic steroid production in Drosophila melanogaster. Development. 141 (20), 3955-3965 (2014).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Rewitz, K. F., Yamanaka, N., Gilbert, L. I., O’Connor, M. B. The Insect Neuropeptide PTTH Activates Receptor Tyrosine Kinase Torso to Initiate Metamorphosis. Science. 326 (5958), 1403-1405 (2009).
- Li, H. -. H., et al. A GAL4 driver resource for developmental and behavioral studies on the larval CNS of Drosophila. Cell Rep. 8 (3), 897-908 (2014).
- Alekseyenko, O. V., Lee, C., Kravitz, E. A. Targeted manipulation of serotonergic neurotransmission affects the escalation of aggression in adult male Drosophila melanogaster. PLOS One. 5 (5), e10806 (2010).
- Domanitskaya, E., Anllo, L., Schüpbach, T. Phantom, a cytochrome P450 enzyme essential for ecdysone biosynthesis, plays a critical role in the control of border cell migration in in Drosophila. Dev. Biol. 386 (2), 408-418 (2014).
- Song, X., Zhu, C. -. H., Doan, C., Xie, T. Germline stem cells anchored by adherens junctions in the Drosophila ovary niches. Science. 296 (5574), 1855-1857 (2002).
- Niwa, Y. S., Niwa, R. Neural control of steroid hormone biosynthesis during development in the fruit fly Drosophila melanogaster. Genes Genet. Syst. 89 (1), 27-34 (2014).
- Yoshiyama-Yanagawa, T., et al. The conserved Rieske oxygenase DAF-36/Neverland is a novel cholesterol-metabolizing enzyme. J. Biol. Chem. 286 (29), 25756-25762 (2011).
- Niwa, R., et al. Non-molting glossy/shroud encodes a short-chain dehydrogenase/reductase that functions in the "Black Box" of the ecdysteroid biosynthesis pathway. Development. 137 (12), 1991-1999 (2010).
- Komura-Kawa, T., et al. The Drosophila Zinc Finger Transcription Factor Ouija Board Controls Ecdysteroid Biosynthesis through Specific Regulation of spookier. PLOS Genet. 11 (12), e1005712 (2015).
- Yamanaka, N., Marqués, G., O’Connor, M. B. Vesicle-Mediated Steroid Hormone Secretion in Drosophila melanogaster. Cell. 163 (4), 907-919 (2015).
- Riemensperger, T., Pech, U., Dipt, S., Fiala, A. Optical calcium imaging in the nervous system of Drosophila melanogaster. BBA-Gen. Subjects. 1820 (8), 1169-1178 (2012).
- Owald, D., Lin, S., Waddell, S. Light, heat, action: neural control of fruit fly behavior. Phil. T. Roy. Soc. B. 370 (1677), 20140211 (2015).
