Protocolos para a visualização de esteroidogênicas Órgãos e seus órgãos interativa com imunocoloração na mosca da fruta<em> Drosophila melanogaster</em
Summary
Nós descrevemos um protocolo para dissecação, fixação e imunocoloração de órgãos esteroidogênicas em Drosophila larvas e adultos do sexo feminino para estudar a biossíntese de hormônios esteróides e seu mecanismo de regulação. Em adição aos órgãos esteroidogênicas, podemos visualizar a inervação dos órgãos esteroidogênicas, bem como células alvo esteroidogênicas, tais como células estaminais da linha germinal.
Abstract
Em organismos multicelulares, um pequeno grupo de células é dotado com uma função especializada na sua actividade biogénico, induzir uma resposta sistémica para o crescimento e reprodução. Em insetos, a glândula larval prothoracic (PG) e as fêmeas adultas de reprodução ovário papéis essenciais no biosynthesizing os principais hormônios esteróides chamados ecdisteroides. Estes órgãos ecdysteroidogenic são inervados do sistema nervoso, através do qual o momento da biossíntese é afetado por estímulos ambientais. Aqui nós descrevemos um protocolo para a visualização de órgãos ecdysteroidogenic e seus órgãos interativos em larvas e adultos de mosca da fruta Drosophila melanogaster, que fornece um sistema modelo adequado para estudar a biossíntese de hormônios esteróides e seu mecanismo de regulação. dissecção Hábil nos permite manter as posições dos órgãos ecdysteroidogenic e seus órgãos interativas, incluindo o cérebro, a medula nervosa ventral, e outros tecidos. Imunomarcação com umntibodies contra enzimas ecdysteroidogenic, juntamente com proteínas de fluorescência transgénicos accionados por promotores específicos de tecido, estão disponíveis para marcar células ecdysteroidogenic. Além disso, os inervação dos órgãos ecdysteroidogenic podem também ser marcados por anticorpos específicos ou um conjunto de controladores de GAL4 em vários tipos de neurónios. Portanto, os órgãos ecdysteroidogenic e as suas ligações neuronais possa ser visualizado simultaneamente por imunocoloração e técnicas transgénicas. Finalmente, descrevemos como visualizar as células-tronco germinativas, cuja proliferação e manutenção são controlados por ecdisteroides. Este método contribui para a compreensão abrangente da biossíntese de hormônios esteróides e seu mecanismo de regulação neuronal.
Introduction
Em organismos multicelulares, um grupo de células é dotado com uma função especializada na sua actividade biogénico que é essencial para o corpo inteiro. Para desempenhar a sua missão, cada tecido ou órgão expressa uma série de genes relacionados com as suas funções e comunica com outros tecidos para orquestrar a sua actividade no âmbito do desenvolvimento. Para caracterizar tais funções celulares especializadas e interacções inter-órgãos, é preciso especificar um grupo de células, juntamente com outros tipos de células a ser mantida intacta na arquitectura multicelular.
Um exemplo de tais órgãos especializados é um órgão esteroidogénica, onde muitas enzimas biossintéticas mediar as etapas de conversão de colesterol para hormonas esteróides activas 1. A maioria destes genes da enzima são especificamente expressos em órgãos esteroidogênicas, e a via de biossíntese é fortemente regulada por diversos estímulos externos através de entradas humorais e entradas neuronais. Uma vezsintetizados, hormonas esteróides são segregados para o hemolinfa e são direccionadas para vários tecidos e órgãos para a regulação da expressão de uma variedade de genes 2. Portanto, a acção de uma hormona esteróide induz uma resposta sistémica para manter a homeostase, crescimento e reprodução.
Para investigar as funções de esteróide biossíntese hormônio e as ações pleiotrópicas de hormônios esteróides, Drosophila melanogaster pode ser utilizado como um sistema modelo adequado. Durante os estágios larvais, a hormona esteróide de insectos, ecdiesteróide, é biossintetizado em um órgão endócrino especializada chamada a glândula prothoracic (PG) 3. Nas PG, várias enzimas ecdysteroidogenic catalisar especificamente os passos de conversão múltiplos a partir do colesterol para ecdisona, que controla a muda e metamorfose nas fases de desenvolvimento apropriadas 4. Portanto, uma mudança dinâmica no título ecdiesteróide é reguladapor muitas vias de sinalização em resposta a estímulos ambientais. Por outro lado, na fase adulta, ecdiesteróide desempenha papéis essenciais na fisiologia, incluindo reprodução, sono, memória, e tempo de vida 5, 6, 7, 8. Sabe-se que ecdiesteróide é biosintetizada activamente no ovário, regulando a progressão da oogese 6, 7, 8, 9, 10, 11. Recentemente, relataram que o número de células estaminais da linha germinal (GSCS) é afectada pela sinalização péptido ecdiesteróide e sexo em resposta a estímulos de acoplamento 12.
Poderosas ferramentas de D. melanogaster genética e biologia celular, incluindo a informação do genoma bem anotada, gene binárioOs sistemas de express, e as técnicas de ARNi transgénicos, permitiram-nos identificar os genes essenciais para a biossíntese de ecdiesteróide no PG e do ovário 13, 14, 15. Uma vez que os genes ecdysteroidogenic são identificadas, a regulação da transcrição destes genes e as localizações dinâmicas de produtos de genes pode ser examinado na via de biossíntese de 16. Para esta finalidade, quantitativa-transcrição reversa-PCR, o RNA de hibridação in situ e a análise imuno-histológica são conduzidos. A aplicação destas técnicas inclui uma tarefa difícil; a dissecção elaborada do PG ou do ovário. Em particular, a PG da mosca da fruta é relativamente mais pequena do que a de outros insectos (por exemplo, o bicho da seda e a mosca varejeira), de modo que é necessário para praticar a habilidade vital da mosca da fruta dissecção para amostragem. Além disso, ambos os órgãos ecdysteroidogenic recebem inervaçãos a partir do sistema nervoso central (SNC), 17, 18, 19, 20. Assim, para análises anatômicas precisas, os órgãos ecdysteroidogenic deve ser mantida intacta, juntamente com o sistema nervoso central e outros órgãos, para não perturbar as suas conexões neuronais.
Aqui nós fornecemos protocolos para a dissecção e visualização de órgãos esteroidogênicas em D. melanogaster. Aprender a técnica de dissecção é o ponto de partida fundamental para essas experiências. Além disso, pode-se com sucesso rotular os órgãos esteroidogênicas, bem como seus órgãos interativos com vários anticorpos e linhas de driver GAL4. Aproveitando estas técnicas, materiais e genética, pode-se estudar os mecanismos abrangentes de esteróide biossíntese da hormona.
Protocol
Representative Results
Discussion
Foram estudados biossíntese ecdiesteróide e o seu mecanismo de regulação em D. melanogaster, e concebido um protocolo para a dissecção e imunocoloração. A temporização da biossíntese de ecdiesteróide é afectada por sinais ambientais através das entradas 33 neuronais, por isso, é essencial para a manutenção da inervação dos órgãos ecdysteroidogenic juntamente com o cérebro, VNC, e outros tecidos durante a dissecção.
Como descrito acima,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos Reiko Kise e Tomotsune Ameku por seu apoio técnico para este trabalho. Também somos gratos a Kei Ito, Olga Alekseyenko, Akiko Koto, Masayuki Miura, o Bloomington Drosophila da Center, Kyoto Stock Center (DGRC), e os estudos de desenvolvimento Hibridoma Bank for stocks e reagentes. Este trabalho foi apoiado por subsídios para YSN de JSPS KAKENHI Grant Número 16K20945, a Fundação Naito, e Inoue Research Award Ciência; e por uma doação para RN de MEXT KAKENHI Grant Número 16H04792.
Materials
| egg collection | |||
| tissue culture dish (55 mm) | AS ONE | 1-8549-02 | for grape-juice agar plates |
| collection cup | HIKARI KAGAKU | ||
| yeast paste | Oriental dry yeast, Tokyo | ||
| 100% grape juice | Welch Food Inc. | ||
| rearing larvae | |||
| small vials (12ml, 40×23.5 mm, PS) | SARSTEDT | 58.487 | |
| disposable loop | AS ONE | 6-488-01 | |
| standard fly food | the recepi us on the website of Blooington stock center. | ||
| dissection | |||
| dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | |
| dissecting microscope | Leica | S8 AP0 | |
| tissue culture dish (35 x 10 mm, non-treated) | IWAKI | 1000-035 | |
| Sylgard | TORAY | coarting silicon inside dishes | |
| Terumo needle (27G, 0.40 x 19 mm) | TERUMO | NN-2719S | A "knife" to cut the tissue |
| Terumo syringe, 1ml | TERUMO | SS-01T | |
| forceps, Inox, #5 | Dumont, Switzerland | ||
| insect pin (0.18 mm in diameter) | Shiga Brand | for fillet dissection | |
| micro scissors | NATSUME SEISAKUSHO CO LTD. | MB-50-10 | |
| fixation | |||
| ultrapure water | Merck Millipore | ||
| phosphate buffered saline (PBS) | |||
| Formaldehyde | Nacalai tesque | 16222-65 | |
| Paraformaldehyde | Nacalai tesque | 02890-45 | |
| Triton-X100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| microtubes (1.5 ml) | INA OPTIKA | CF-0150 | |
| Incubation | |||
| As one swist mixer TM-300 (rocker) | As one | TM-300 | rocker |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | 9048-46-8 | |
| primary antibody | |||
| anti-Sro (guinea pig), 1:1000 | |||
| anti-GFP (rabbit), 1:1000 | Molecular Probes | A6455 | Shimada-Niwa ans Niwa, 2014 |
| anti-GFP (mouse mAb, GF200), 1:100 | Nakarai tesque | 04363-66 | |
| anti-5HT (rabbit), 1:500 | SIGMA | S5545 | |
| anti-Hts 1B1 (mouse) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 1B1 | |
| anti-DE-cadherin (rat), 1:20 | DSHB | DCAD2 | |
| anti-nc82 (mouse), 1:50 | DSHB | nc82 | |
| secondary antibody | |||
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-11008 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-11001 | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate | Life Technologies | A-11081 | |
| Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | Life Technologies | A-21435 | |
| Alexa Fluor 546 dye-conjugated phalloidin | Life Technologies | A-22283 | |
| Mounting reagents | |||
| Micro slide glass | Matsunami Glass Ind.,Ltd. | SS7213 | |
| Square microscope cover glass | Matsunami Glass Ind.,Ltd. | C218181 | |
| FluorSave reagent (Mounting reagent) | Calbiochem | 345789 | |
| Transfer pipette 1 ml (Disposable dropper) | WATSON | 5660-222-1S | |
| imaging | |||
| LSM700 laser scanning microscope system | Carl Zeiss | inverted Axio Observer. Z1 SP left | |
| image processing | |||
| LSM700 ZEN | Carl Zeiss | It is a special user interface based on the 64 bit Microsoft Windows7 operating system | |
| ImageJ | |||
| Fly stocks | |||
| w; GMR45C06-GAL4 | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260) | ||
| UAS–GFP; UAS–mCD8::GFP | gifts from K. Ito, The University of Tokyo. | ||
| w[1118] | |||
| w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP | |||
| w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4 | see in Ref29, Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A.(2010) | ||
| w; UAS-mCD8::GFP | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188) | ||
| yw;; nSyb-GAL4 | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941) |
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