Протоколы Визуальное стероидогенных органов и их интерактивные Органов с иммунным окрашиванием плодовой мушки<em> Дрозофилы</em
Summary
Мы опишем протокол для рассечения, фиксации и иммунных стероидогенных органов у дрозофилы личинок и взрослые самок для изучения стероидного биосинтеза гормонов и его механизма регулирования. Помимо стероидогенеза органов, мы визуализируем иннервации стероидогенных органов, а также стероидогенеза клеток-мишеней, таких как зародышевые стволовые клетки.
Abstract
В многоклеточных организмах, небольшая группа клеток наделена специализированная функцией в их биогенной активности, вызывая системную реакцию на рост и размножение. У насекомых, личинок переднегрудная железа (PG) и взрослая женщина играют яичники существенной роль в биосинтезе основных стероидных гормонов, называемых Экдистероидами. Эти ecdysteroidogenic органы иннервируются от нервной системы, с помощью которой время биосинтеза пораженного сигналов окружающей среды. Здесь мы опишем протокол для визуализации ecdysteroidogenic органов и их интерактивных органов у личинок и взрослых плодовой мушки дрозофилы, которая обеспечивает подходящую модельную систему для изучения биосинтеза стероидных гормонов и его механизма регулирования. Умелое рассечение позволяет нам поддерживать позиции ecdysteroidogenic органов и их интерактивные органы, включая мозг, брюшную нервную цепочку, и другие ткани. Иммуноокрашивание сntibodies против ecdysteroidogenic ферментов, наряду с трансгенными белками флуоресценции, управляемых ткане-специфических промоторов, доступны для обозначения ecdysteroidogenic клеток. Кроме того, иннервации ecdysteroidogenic органов также могут быть помечены специфическими антителами или коллекцией GAL4 драйверов в различных типах нейронов. Таким образом, ecdysteroidogenic органы и их нейронные связи могут быть визуализированы одновременно иммунным окрашиванием и трансгенных методов. Наконец, мы опишем, как визуализировать зародышевые стволовые клетки, чье распространение и технические обслуживание контролируются экдистероидами. Этот метод способствует всестороннему пониманию стероидного биосинтеза гормонов и его нейронного механизма регулирования.
Introduction
У многоклеточных организмов, группа клеток обладают специализированной функцией в их биогенной деятельности, которая имеет важное значение для всего тела. Для выполнения своих задач, каждая ткань или орган выражает ряд генов, связанные с их функциями и взаимодействует с другими тканями, чтобы организовать свою деятельность в контексте развития. Для того, чтобы охарактеризовать такие специализированные клеточные функции и взаимодействие между органами, необходимо указать группу клеток, а также другие типы клеток быть сохранены в многоклеточных архитектурах.
Одним из примеров таких специализированных органов являются стероидогенным органом, где многие ферменты биосинтеза опосредуют стадию конверсии из холестерина в активные стероидных гормоны 1. Большинство из этих генов ферментов специфический экспрессируется в стероидогенных органах, а также путь биосинтеза жестко регулируются многими внешними стимулами через гуморальные входы и нейронные входы. однаждыСинтезированные, стероидные гормоны секретируются в гемолимфу и ориентированы на многие ткани и органы для регуляции экспрессии различных генов 2. Таким образом, действие стероидного гормона индуцирует системный ответ для поддержания гомеостаза, роста и размножения.
Для того, чтобы исследовать функции биосинтеза стероидных гормонов и плейотропных действия стероидных гормонов, дрозофилы могут быть использованы в качестве подходящей модельной системы. Во время личиночной стадии, насекомое стероидный гормон, экдистероидов, биосинтезируется в специализированном эндокринный орган называется проторакальной железы (PG) 3. В PG, несколько ecdysteroidogenic ферментов специфически катализировать несколько шагов преобразования из холестерина в экдизона, который управляет линьки и метаморфоза на соответствующих стадиях развития 4. Таким образом, динамическое изменение титра экдистероидов регулируетсямногие сигнальных пути в ответ на сигналы окружающей среды. С другой стороны, на стадии взрослого, экдистероидный играет существенную роль в физиологии, в то числе воспроизведения, сна, памяти, и продолжительностью жизни 5, 6, 7, 8. Известно , что экдистероиды активно синтезируются в яичниках, регулирующее прогрессирование оогенеза 6, 7, 8, 9, 10, 11. Недавно мы сообщали о том , что число зародышевых стволовых клеток (GSCs) зависит от экдистероидов и половой пептидной сигнализации в ответ на стимулы вязки 12.
Мощные инструменты дрозофилы генетики и клеточной биологии, в том числе хорошо аннотированной информации генома, двоичный генсистемы экспрессии и трансгенный RNAi метода, которые позволили нам идентифицировать гены , необходимые для экдистероидсодержащего биосинтеза в PG и яичник 13, 14, 15. После того , как ecdysteroidogenic гены идентифицированы, регуляция транскрипции этих генов и динамических локализации генных продуктов может быть исследована в пути биосинтеза 16. Для этой цели количественно-обратной транскрипции-ПЦР, РНК гибридизация и иммуногистохимического анализа проводятся в. Применение этих методов включает в себя сложную задачу; Сложное рассечение PG или яичника. В частности, PG из плодовой мушки относительно меньше , чем у других насекомых (например , шелкопряд и удар муха), поэтому нужно практиковать жизненно важный навык плодовой мушки рассечение для отбора проб. Кроме того, оба ecdysteroidogenic органы получают иннервациюы из центральной нервной системы (ЦНС) 17, 18, 19, 20. Таким образом, для точных анатомических анализов, ecdysteroidogenic органы должны быть сохранены вместе с ЦНС и другими органами, чтобы не нарушить их нейронные связи.
Здесь мы предлагаем протоколы вскрытия и визуализации стероидогенных органов в D. MELANOGASTER. Изучение техники рассечения является ключевой отправной точкой для этих экспериментов. Кроме того, можно успешно маркировать стероидогенные органы, а также их интерактивные органы с несколькими антителами и линиями драйвера GAL4. Пользуясь этими методы, материалов и генетики, можно изучать комплексные механизмы биосинтеза стероидных гормонов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы изучали экдистероиды биосинтеза и его механизм регулирования в дрозофиле, и разработали протокол вскрытия и иммунное окрашивание. Сроки экдистероидов биосинтеза зависят от окружающей среды сигналов через нейронные входы 33, так что имеет важное значение для подде…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Рейко Кисы и Tomotsune Ameku за техническую поддержку этой работы. Мы также благодарны Кей Ито, Ольга Алексеенко, Акико Кото, Масаюки Миура, фондовый центр Блумингтона дрозофилы, КИОТСКАЯ Stock Center (DGRC), а также с развитием исследованиями гибрид банк запасов и реагентами. Эта работа была поддержана грантами на YSN из JSPS KAKENHI Грант Номер 16K20945, The Найто Foundation и премии Исследовательского Inoue науки; и грант в RN от МПКСНТА KAKENHI Гранта Номер 16H04792.
Materials
| egg collection | |||
| tissue culture dish (55 mm) | AS ONE | 1-8549-02 | for grape-juice agar plates |
| collection cup | HIKARI KAGAKU | ||
| yeast paste | Oriental dry yeast, Tokyo | ||
| 100% grape juice | Welch Food Inc. | ||
| rearing larvae | |||
| small vials (12ml, 40×23.5 mm, PS) | SARSTEDT | 58.487 | |
| disposable loop | AS ONE | 6-488-01 | |
| standard fly food | the recepi us on the website of Blooington stock center. | ||
| dissection | |||
| dissecting microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | |
| dissecting microscope | Leica | S8 AP0 | |
| tissue culture dish (35 x 10 mm, non-treated) | IWAKI | 1000-035 | |
| Sylgard | TORAY | coarting silicon inside dishes | |
| Terumo needle (27G, 0.40 x 19 mm) | TERUMO | NN-2719S | A "knife" to cut the tissue |
| Terumo syringe, 1ml | TERUMO | SS-01T | |
| forceps, Inox, #5 | Dumont, Switzerland | ||
| insect pin (0.18 mm in diameter) | Shiga Brand | for fillet dissection | |
| micro scissors | NATSUME SEISAKUSHO CO LTD. | MB-50-10 | |
| fixation | |||
| ultrapure water | Merck Millipore | ||
| phosphate buffered saline (PBS) | |||
| Formaldehyde | Nacalai tesque | 16222-65 | |
| Paraformaldehyde | Nacalai tesque | 02890-45 | |
| Triton-X100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| microtubes (1.5 ml) | INA OPTIKA | CF-0150 | |
| Incubation | |||
| As one swist mixer TM-300 (rocker) | As one | TM-300 | rocker |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | 9048-46-8 | |
| primary antibody | |||
| anti-Sro (guinea pig), 1:1000 | |||
| anti-GFP (rabbit), 1:1000 | Molecular Probes | A6455 | Shimada-Niwa ans Niwa, 2014 |
| anti-GFP (mouse mAb, GF200), 1:100 | Nakarai tesque | 04363-66 | |
| anti-5HT (rabbit), 1:500 | SIGMA | S5545 | |
| anti-Hts 1B1 (mouse) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | 1B1 | |
| anti-DE-cadherin (rat), 1:20 | DSHB | DCAD2 | |
| anti-nc82 (mouse), 1:50 | DSHB | nc82 | |
| secondary antibody | |||
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-11008 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A-11001 | |
| Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate | Life Technologies | A-11081 | |
| Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | Life Technologies | A-21435 | |
| Alexa Fluor 546 dye-conjugated phalloidin | Life Technologies | A-22283 | |
| Mounting reagents | |||
| Micro slide glass | Matsunami Glass Ind.,Ltd. | SS7213 | |
| Square microscope cover glass | Matsunami Glass Ind.,Ltd. | C218181 | |
| FluorSave reagent (Mounting reagent) | Calbiochem | 345789 | |
| Transfer pipette 1 ml (Disposable dropper) | WATSON | 5660-222-1S | |
| imaging | |||
| LSM700 laser scanning microscope system | Carl Zeiss | inverted Axio Observer. Z1 SP left | |
| image processing | |||
| LSM700 ZEN | Carl Zeiss | It is a special user interface based on the 64 bit Microsoft Windows7 operating system | |
| ImageJ | |||
| Fly stocks | |||
| w; GMR45C06-GAL4 | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260) | ||
| UAS–GFP; UAS–mCD8::GFP | gifts from K. Ito, The University of Tokyo. | ||
| w[1118] | |||
| w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP | |||
| w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4 | see in Ref29, Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A.(2010) | ||
| w; UAS-mCD8::GFP | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188) | ||
| yw;; nSyb-GAL4 | from Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941) |
References
- Miller, W. L., Auchus, R. J. The Molecular Biology, Biochemistry, and Physiology of Human Steroidogenesis and Its Disorders. Endocr. Rev. 32 (1), 81-151 (2011).
- Rousseau, G. G. Fifty years ago: The quest for steroid hormone receptors. Mol. Cell. Endocrinol. 375 (1), 10-13 (2013).
- Gilbert, L. I., Rybczynski, R., Warren, J. T. Control and biochemical nature of the ecdysteroidogenic pathway. Annu. Rev. Entomol. 47, 883-916 (2002).
- Niwa, R., Niwa, Y. S. Enzymes for ecdysteroid biosynthesis: their biological functions in insects and beyond. Biosci. Biotechnol. Biochem. 78 (8), 1283-1292 (2014).
- Kozlova, T., Thummel, C. S. Steroid regulation of postembryonic development and reproduction in drosophila. Trends Endocrinol. Metab. 11 (7), 276-280 (2000).
- Ishimoto, H., Kitamoto, T. Beyond molting-roles of the steroid molting hormone ecdysone in regulation of memory and sleep in adult Drosophila. Fly. 5 (3), 215-220 (2011).
- Ishimoto, H., Sakai, T., Kitamoto, T. Ecdysone signaling regulates the formation of long-term courtship memory in adult Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (15), 6381-6386 (2009).
- Simon, A. F., Shih, C., Mack, A., Benzer, S. Steroid control of longevity in Drosophila melanogaster. Science. 299 (5611), 1407-1410 (2003).
- Buszczak, M., Freeman, M. R., Carlson, J. R., Bender, M., Cooley, L., Segraves, W. a Ecdysone response genes govern egg chamber development during mid-oogenesis in Drosophila. Development. 126 (20), 4581-4589 (1999).
- Carney, G. E., Bender, M. The drosophila ecdysone receptor (EcR) gene is required maternally for normal oogenesis. Genetics. 154 (3), 1203-1211 (2000).
- Uryu, O., Ameku, T., Niwa, R. Recent progress in understanding the role of ecdysteroids in adult insects: Germline development and circadian clock in the fruit fly Drosophila melanogaster. Zoological Lett. 1, 32 (2015).
- Ameku, T., Niwa, R. Mating-Induced Increase in Germline Stem Cells via the Neuroendocrine System in Female Drosophila. PLOS Genet. 12 (6), e1006123 (2016).
- Danielsen, E. T., et al. A Drosophila Genome-Wide Screen Identifies Regulators of Steroid Hormone Production and Developmental Timing. Dev. Cell. 37 (6), 558-570 (2016).
- Ou, Q., Zeng, J., Yamanaka, N., Brakken-Thal, C., O’Connor, M. B., King-Jones, K. The Insect Prothoracic Gland as a Model for Steroid Hormone Biosynthesis and Regulation. Cell Rep. , (2016).
- Yamanaka, N., Rewitz, K. F., O’Connor, M. B. Ecdysone control of developmental transitions: lessons from Drosophila research. Annu. Rev. Entomol. 58, 497-516 (2013).
- Niwa, Y. S., Niwa, R. Transcriptional regulation of insect steroid hormone biosynthesis and its role in controlling timing of molting and metamorphosis. Dev. Growth Differ. 58, 94-105 (2015).
- Monastirioti, M. Distinct octopamine cell population residing in the CNS abdominal ganglion controls ovulation in Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 264 (1), 38-49 (2003).
- Siegmund, T., Korge, G. Innervation of the ring gland of Drosophila melanogaster. J. Comp. Neurol. 431 (4), 481-491 (2001).
- McBrayer, Z., et al. Prothoracicotropic Hormone Regulates Developmental Timing and Body Size in Drosophila. Dev. Cell. 13 (6), 857-871 (1979).
- Shimada-Niwa, Y., Niwa, R. Serotonergic neurons respond to nutrients and regulate the timing of steroid hormone biosynthesis in Drosophila. Nat. Commun. 5, 5778 (2014).
- Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bull World Health Organ. 32 (1), 143-144 (1965).
- Abramoff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics Int. 11 (7), 36-42 (2004).
- Ohhara, Y., et al. Autocrine regulation of ecdysone synthesis by β3-octopamine receptor in the prothoracic gland is essential for Drosophila metamorphosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (5), 1452-1457 (2015).
- Gibbens, Y. Y., Warren, J. T., Gilbert, L. I., O’Connor, M. B. Neuroendocrine regulation of Drosophila metamorphosis requires TGFbeta/Activin signaling. Development. 138 (13), 2693-2703 (2011).
- Parvy, J. P., et al. A role for βFTZ-F1 in regulating ecdysteroid titers during post-embryonic development in Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 282 (1), 84-94 (2005).
- Parvy, J. -. P., et al. Forward and feedback regulation of cyclic steroid production in Drosophila melanogaster. Development. 141 (20), 3955-3965 (2014).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Rewitz, K. F., Yamanaka, N., Gilbert, L. I., O’Connor, M. B. The Insect Neuropeptide PTTH Activates Receptor Tyrosine Kinase Torso to Initiate Metamorphosis. Science. 326 (5958), 1403-1405 (2009).
- Li, H. -. H., et al. A GAL4 driver resource for developmental and behavioral studies on the larval CNS of Drosophila. Cell Rep. 8 (3), 897-908 (2014).
- Alekseyenko, O. V., Lee, C., Kravitz, E. A. Targeted manipulation of serotonergic neurotransmission affects the escalation of aggression in adult male Drosophila melanogaster. PLOS One. 5 (5), e10806 (2010).
- Domanitskaya, E., Anllo, L., Schüpbach, T. Phantom, a cytochrome P450 enzyme essential for ecdysone biosynthesis, plays a critical role in the control of border cell migration in in Drosophila. Dev. Biol. 386 (2), 408-418 (2014).
- Song, X., Zhu, C. -. H., Doan, C., Xie, T. Germline stem cells anchored by adherens junctions in the Drosophila ovary niches. Science. 296 (5574), 1855-1857 (2002).
- Niwa, Y. S., Niwa, R. Neural control of steroid hormone biosynthesis during development in the fruit fly Drosophila melanogaster. Genes Genet. Syst. 89 (1), 27-34 (2014).
- Yoshiyama-Yanagawa, T., et al. The conserved Rieske oxygenase DAF-36/Neverland is a novel cholesterol-metabolizing enzyme. J. Biol. Chem. 286 (29), 25756-25762 (2011).
- Niwa, R., et al. Non-molting glossy/shroud encodes a short-chain dehydrogenase/reductase that functions in the "Black Box" of the ecdysteroid biosynthesis pathway. Development. 137 (12), 1991-1999 (2010).
- Komura-Kawa, T., et al. The Drosophila Zinc Finger Transcription Factor Ouija Board Controls Ecdysteroid Biosynthesis through Specific Regulation of spookier. PLOS Genet. 11 (12), e1005712 (2015).
- Yamanaka, N., Marqués, G., O’Connor, M. B. Vesicle-Mediated Steroid Hormone Secretion in Drosophila melanogaster. Cell. 163 (4), 907-919 (2015).
- Riemensperger, T., Pech, U., Dipt, S., Fiala, A. Optical calcium imaging in the nervous system of Drosophila melanogaster. BBA-Gen. Subjects. 1820 (8), 1169-1178 (2012).
- Owald, D., Lin, S., Waddell, S. Light, heat, action: neural control of fruit fly behavior. Phil. T. Roy. Soc. B. 370 (1677), 20140211 (2015).
