昆虫細胞を調製し、mCD1d四量体を生成する組換えmCD1d proteinandの生産を目的とバキュロウイルスとそれらを感染させる方法。
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この記事について
サマリー
要約
CD1タンパク質は、抗原提示分子の第3のクラスを構成する。彼らは、非共有結合β2-ミクログロブリンに関連付けられている約50 - kDaのグリコシル化重鎖として表現される細胞表面の糖タンパク質です。彼らは脂質ではなく、ペプチドを結合する。それらの構造がMHCクラスIとクラスIIの抗原提示分子にCD1タンパク質の類似性を確認するものの、mCD1d溝は相対的に、狭く深く、そして非常に疎水性であり、それは古典的で説明したいくつかの浅いポケットの代わりに二つの結合ポケットを有するMHC -エンコードされた抗原提示分子。それらのアミノ酸配列に基づいて、そのようなhydrobphobic溝は脂質抗原の結合のための理想的な環境を提供します。
ナチュラルキラーT（NKT）細胞は、CD1dによってバインドされるか提示糖脂質を認識するために彼らのTCRを使用してください。 CD1から提示された脂質に反応性T細胞は自己免疫と感染症予防にと腫瘍拒絶に関与してきた。したがって、識別、浄化とcd1 -反応性NKT細胞の応答を追跡する機能は非常に重要です。 CD1dによるアルファガラクトシルセラミド（α- GalCerを）の四量体の生成は、NKT細胞の生物学の重要な洞察を持っています。他のCD1分子から構成された四量体も生成されており、これらの新しい試薬を大幅に脂質反応性T細胞の機能の知識を拡大し、脂質ベースのワクチンに対する応答を監視することで、自己免疫疾患やその他の診断に利用できる可能性を治療法。
プロトコル
I.は、セルを融解
TN5細胞の凍結バイアルを取る、そして37℃の水浴中で解凍します。 25センチメートル2 TCフラスコ内の昆虫エクスプレス培地（Invitrogen、カタログ番号- 10486）5mlを追加します。エクスプレス5人がグルタミンなしで来ることに注意してください。100Xグルタミンペンの連鎖球菌または1 LTのメディアに単独でグルタミン10mlのを追加する必要があります。それにTN5細胞を追加し、27℃インキュベーターで30分間インキュベートする。その後、フラスコの底に付着した細胞を乱すことなく静かにDMSOと培地を吸引除去する。新鮮培地5mlを追加します。
II。細胞の成長と拡大
毎日のセルを監視する。フラスコを約70％コンフルエントになると、両側にフラスコを叩いにより懸濁液中の細胞をもたらすと昆虫エクスプレス培地と細胞培養5mlの21 mlを加え175センチメートル2フラスコに細胞を移す。各T175フラスコは、最終的なボリュームとして25〜30ミリリットル培地で入力してください。コンフルエントフラスコを（約1万/ミリリットル濃）1 / 4、1 / 5必要に応じて分割する。細胞の生い茂るをさせてください。セルを分割している通路の数を数えます。それは細胞溶解を生じる細胞の老化を引き起こす可能性があるため、継代数30の....
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ディスカッション
この手順では、それは、開始の成長、昆虫細胞に感染し、これらの細胞を用いてバキュロウイルスの力価方法をする方法を示されています。この手順の最も重要な側面は、細胞の維持であり、バキュロウイルスの正確な力価を知ることができます。一度CD1四量体を生成して、それらが糖脂質反応性T細胞の解析のための強力なツールとして使用することができます。バキュロウイルスシステムは、この手順では、はるかに広い適用性を持つように、MHCクラスIIテトラマーを含む組換えタンパク質を生成するために広く使用されています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント | |
|---|---|---|---|---|
| Express Five SFM | 無血清培地 | Invitrogen | 10486025 | |
| High Five TM | 昆虫細胞 | Invitrogen | B855-02 | |
| Glutamine Pen strep | 抗生物質 | Invitrogen | 10378-016 | |
| 25cm2 TC Flask | プラスチック | Fisher Scientific | 10-126-28 | |
| 175 cm2 TC Flask | プラグシールフラスコ | Fisher Scientific | 10-126-8 | |
| Erlenmeyer Flask | 細胞培養フラスコ | Fisher Scientific | 07 200 672 | |
| YM 30 Concenterator | 30,000 MWCO | EMD Millipore | UFC 903096 | |
| FPLC装置 | GE Healthcare | |||
| BrA酵素およびバッファー | ビオチン化キット | Avidity | BIRA500 | |
| Ni-NTAアガロースカラム | Hisタグタンパク質精製カラム | GE Healthcare | ||
| 脱塩カラム | タンパク質からの塩の除去用 | GE Healthcare | ||
| MonoQカラム | 陰イオン交換クロマトグラフィー | GE Healthcare | ||
| S200カラム | サイズ排除クロマトグラフィー | GE Healthcare | ||
| alpha-Galcer | 糖脂質 | |||
| PE-Streptavidin | タンパク質接合用 | Molecular Probes, Life Technologies | S-866 |
参考文献
- Benlagha, K., Weiss, A., Beavis, A., Teyton, L., Bendelac, A. In vivo identification of glycolipipd antigen-specific T cells using fluorecent CD1d tetramers. J. Exp. Med. 191, 1895-1903 (2000).
- Kinjo, Y., Wu, D., Kim, G., Xing, G. W., Poles, M. A., Ho, D. D., Tsuji, M., Kawahara, K., Wong, C. H., Kronenberg, M.
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