昆虫細胞における組換えmCD1dタンパク質の製造方法。
Summary
昆虫細胞を調製し、mCD1d四量体を生成する組換えmCD1d proteinandの生産を目的とバキュロウイルスとそれらを感染させる方法。
Abstract
CD1タンパク質は、抗原提示分子の第3のクラスを構成する。彼らは、非共有結合β2-ミクログロブリンに関連付けられている約50 – kDaのグリコシル化重鎖として表現される細胞表面の糖タンパク質です。彼らは脂質ではなく、ペプチドを結合する。それらの構造がMHCクラスIとクラスIIの抗原提示分子にCD1タンパク質の類似性を確認するものの、mCD1d溝は相対的に、狭く深く、そして非常に疎水性であり、それは古典的で説明したいくつかの浅いポケットの代わりに二つの結合ポケットを有するMHC -エンコードされた抗原提示分子。それらのアミノ酸配列に基づいて、そのようなhydrobphobic溝は脂質抗原の結合のための理想的な環境を提供します。
ナチュラルキラーT（NKT）細胞は、CD1dによってバインドされるか提示糖脂質を認識するために彼らのTCRを使用してください。 CD1から提示された脂質に反応性T細胞は自己免疫と感染症予防にと腫瘍拒絶に関与してきた。したがって、識別、浄化とcd1 -反応性NKT細胞の応答を追跡する機能は非常に重要です。 CD1dによるアルファガラクトシルセラミド（α- GalCerを）の四量体の生成は、NKT細胞の生物学の重要な洞察を持っています。他のCD1分子から構成された四量体も生成されており、これらの新しい試薬を大幅に脂質反応性T細胞の機能の知識を拡大し、脂質ベースのワクチンに対する応答を監視することで、自己免疫疾患やその他の診断に利用できる可能性を治療法。
Protocol
Discussion
この手順では、それは、開始の成長、昆虫細胞に感染し、これらの細胞を用いてバキュロウイルスの力価方法をする方法を示されています。この手順の最も重要な側面は、細胞の維持であり、バキュロウイルスの正確な力価を知ることができます。一度CD1四量体を生成して、それらが糖脂質反応性T細胞の解析のための強力なツールとして使用することができます。バキュロウイルスシステムは、この手順で…
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Express Five SFM | Serum Free Medium | Invitrogen | 10486025 | |
| High Five TM | Insect Cells | Invitrogen | B855-02 | |
| Glutamine Pen strep | Antibiotics | Invitrogen | 10378-016 | |
| 25cm2 TC Flask | Plastic | Fisher | 10-126-28 | |
| 175 cm2 TC Flask | Plug seal flask | Fisher | 10-126-8 | |
| Erlenmeyer Flask | Cell Culture Flask | Fisher | 07 200 672 | |
| YM 30 Concenterator | 30,000 MWCO | Millipore | UFC 903096 | |
| FPLC equipment | GE Healthcare | |||
| BrA Enzyme and Buffer | Biotinylation Kit | Avidity | BIRA500 | |
| Ni-NTA Agarose Column | His Tag Protein Purification Column | GE Healthcare | ||
| Desalting column | To get Rod of Salt from Protein | GE Healthcare | ||
| MonoQ Column | Anion Exchange Chromatgraphy | GE Healthcare | ||
| S200 Column | Size Exclusion Chromatography | GE Healthcare | ||
| alpha-Galcer | Glycolipid | |||
| PE- Streptavidin | For conjugating Protein | Molecular Probe | S-866 |
References
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