Rekombinant mCD1d Böcek Hücrelerde Protein Üretimi İçin Bir Yöntem.
Summary
Böcek hücreleri hazırlamak ve onları mCD1d tetramers üreten rekombinant mCD1d proteinand üretimi amacı bakülovirüs ile enfekte Bir Yöntem.
Abstract
CD1 proteinler antijen sunan moleküllerin üçüncü sınıf oluşturmaktadır. Onlar noncovalently beta2-mikroglobulin ile ilgili yaklaşık 50 kDa glikozile ağır zincir olarak ifade edilen hücre yüzey glikoprotein. Bu lipidler ziyade peptidler bağlanır. Kendi yapısı MHC sınıf I ve sınıf II antijen sunan moleküllerin CD1 proteinlerin benzerlik teyit rağmen, mCD1d oluk nispeten dar, derin ve son derece hidrofobik ve klasik için açıklanan birkaç sığ cepleri yerine iki bağlayıcı cepleri var MHC antijen sunan moleküller kodlanmış. Kendi amino asit dizilerinin dayanarak, böyle bir hydrobphobic oluk lipid antijenlerin bağlanması için ideal bir ortam sağlar.
Doğal Öldürücü T (NKT) hücreleri, bağlı veya CD1d tarafından sunulan glikolipitler tanımak için kendi TCR kullanın. CD1 tarafından sunulan lipidler reaktif T hücrelerinin otoimmün ve bulaşıcı hastalıklara karşı koruma ve tümör rejeksiyon dahil edilmiştir. Böylece, CD1-reaktif NKT hücre yanıtı belirlemek, arındırmak ve izlemek için yeteneği büyük önem taşımaktadır. CD1d alfa Galactosyl seramid (a-Galcer) tetramers nesil NKT hücreleri biyoloji önemli bir anlayışa sahiptir. Diğer CD1 molekülleri inşa Tetramers de üretilen edilmiş ve bu yeni reaktifleri lipid tabanlı aşılara yanıt izlenmesinde potansiyel kullanımı ile büyük ölçüde ve otoimmün hastalıklar ve diğer tanı, lipid-reaktif T hücrelerinin fonksiyonları bilgi genişlettik tedaviler.
Protocol
Discussion
Bu yöntemde, başlatmak, büyümek, Böcek hücreleri enfekte ve bu hücreleri kullanarak bakülovirüs nasıl titresi nasıl gösterilir. Bu prosedürün en önemli yönlerinden hücrelerin korunması ve bakülovirüs tam titresi bilmek. CD1 tetramers yarattı, onlar glikolipid reaktif T hücrelerinin analizi için güçlü bir araç olarak kullanılabilir. Baculovirus sistemleri de MHC sınıf II tetramers bu nedenle bu işlemi çok daha geniş uygulanabilirliği içeren rekombinant proteinler üretmek için yaygın olarak kullanılmakta…
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Express Five SFM | Serum Free Medium | Invitrogen | 10486025 | |
| High Five TM | Insect Cells | Invitrogen | B855-02 | |
| Glutamine Pen strep | Antibiotics | Invitrogen | 10378-016 | |
| 25cm2 TC Flask | Plastic | Fisher | 10-126-28 | |
| 175 cm2 TC Flask | Plug seal flask | Fisher | 10-126-8 | |
| Erlenmeyer Flask | Cell Culture Flask | Fisher | 07 200 672 | |
| YM 30 Concenterator | 30,000 MWCO | Millipore | UFC 903096 | |
| FPLC equipment | GE Healthcare | |||
| BrA Enzyme and Buffer | Biotinylation Kit | Avidity | BIRA500 | |
| Ni-NTA Agarose Column | His Tag Protein Purification Column | GE Healthcare | ||
| Desalting column | To get Rod of Salt from Protein | GE Healthcare | ||
| MonoQ Column | Anion Exchange Chromatgraphy | GE Healthcare | ||
| S200 Column | Size Exclusion Chromatography | GE Healthcare | ||
| alpha-Galcer | Glycolipid | |||
| PE- Streptavidin | For conjugating Protein | Molecular Probe | S-866 |
References
- Benlagha, K., Weiss, A., Beavis, A., Teyton, L., Bendelac, A. In vivo identification of glycolipipd antigen-specific T cells using fluorecent CD1d tetramers. J. Exp. Med. 191, 1895-1903 (2000).
- Kinjo, Y., Wu, D., Kim, G., Xing, G. W., Poles, M. A., Ho, D. D., Tsuji, M., Kawahara, K., Wong, C. H., Kronenberg, M. Recognition of bacterial glycosphingolipids by natural killer T cells. Nature. 434, 520-525 (2005).
- Naidenko, O. V., Maher, J. K., Ernst, W. A., Sakai, T., Modlin, R. L., Kronenberg, M. Binding and antigen presentation of ceramide-containing glycolipids by soluble mouse and human CD1d molecules. J. Exp. Med. 190, 1069-1080 (1999).
- Porcelli, S. A. The CD1 family: A third lineage of antigen- presenting molecules. Adv. Immunol. 59, 1-98 (1995).
- Sidobre, S., Kronemberg, M. CD1 tetramers: A powerful tool for the analysis of glycolipid-reactive T cells. J. Immunol. 169, 1340-1348 (2002).
