Um método para preparar células de insetos e infectá-las com baculovírus com a finalidade de produção de recombinantes proteinand mCD1d gerando tetrâmeros mCD1d.
Abstract
CD1 proteínas constituem uma terceira classe de moléculas apresentadoras de antígenos. Eles são glicoproteínas de superfície celular, expressos em aproximadamente 50 kDa glicosilada cadeias pesadas que são não covalentemente associados com beta2-microglobulina. Eles se ligam lipídios ao invés de peptídeos. Embora sua estrutura confirma a semelhança das proteínas CD1 ao MHC de classe I e moléculas de classe II apresentando antígeno, o sulco mCD1d é relativamente estreita, profunda e altamente hidrofóbico e tem dois bolsos de ligação em vez dos vários bolsos rasos descrito para o clássico MHC- codificados moléculas apresentadoras de antígenos. Com base em suas seqüências de aminoácidos, como um sulco hydrobphobic fornece um ambiente ideal para a ligação de antígenos lipídicos.
A Natural Killer T (NKT) usar suas células TCR a reconhecer glycolipids vinculado ou apresentados por CD1d. Células T reativas a lipídeos apresentado por CD1 estiveram envolvidos na proteção contra doenças auto-imunes e infecciosas e na rejeição do tumor. Assim, a capacidade de identificar, purificar e controlar a resposta do CD1-reativa de células NKT é de grande importância. A geração de tetrâmeros de alfa galactosyl ceramida (a-GalCer) com CD1d tem uma visão significativa sobre a biologia das células NKT. Tetrâmeros construído a partir de outras moléculas CD1 também têm sido gerados e estes novos reagentes têm expandido o conhecimento das funções das células lipídicas reativa T, com uso potencial no monitoramento da resposta ao lipídica baseado em vacinas e no diagnóstico de doenças auto-imunes e outras tratamentos.
Protocol
I. Descongele as células Pegue o frasco frozen de TN5 células, e descongele-o em banho-maria a 37 ° C. Adicionar 5ml de inseto médio Express (Invitrogen, catálogo número 10.486), em 25 centímetros frasco TC 2. Note-se que cinco expresso vem sem Glutamina; precisa adicionar 10ml de strep caneta 100X glutamina ou glutamina sozinha para uma mídia lt. Adicionar TN5 células dentro dele e incubar por 30 minutos em 27 ° C incubadora. Então, aspirado o meio com DMSO delicadamente,…
Discussion
Neste procedimento, é mostrado como iniciar, crescer, infectar células de inseto e como título do baculovírus uso dessas células. Os aspectos mais importantes deste processo são a manutenção de células e de saber o título exato de baculovírus. Depois de ter gerado CD1 tetrâmeros, que pode ser usado como uma poderosa ferramenta para análise de células T glicolipídeo reativa. Sistemas de baculovírus também são amplamente utilizados para a produção de proteínas recombinantes, incluindo tetrâmeros de MHC classe II de modo …