곤충 세포에서 재조합 단백질의 생산 mCD1d하는 방법.
Summary
곤충 세포를 준비하고 mCD1d tetramers를 생성하는 재조합 mCD1d의 proteinand의 생산의 목적으로 baculovirus으로 그들을 감염하는 방법.
Abstract
CD1 단백질은 항원 제시 분자의 세 번째 클래스를 구성합니다. 그들은 noncovalently beta2 – microglobulin과 관련된 약 50 KDA glycosylated 무거운 사슬로 표현 세포 표면 glycoproteins입니다. 그들은 lipids보다는 펩티드를 바인딩합니다. 그들의 구조가 MHC 클래스 I 및 클래스 II의 항원 제시 분자로 CD1 단백질의 유사성을 확인했지만, mCD1d 홈은 비교적 좁은 깊이, 그리고 높은 소수성이며, 그것은 고전에 대한 설명 여러 얕은 주머니 대신에 두개의 바인딩 주머니를 가지고 MHC – 항원 제시 분자를 인코딩. 자신의 아미노산 시퀀스에 따라, 그러한 hydrobphobic 홈은 지질 항원의 바인딩을위한 이상적인 환경을 제공합니다.
자연 킬러 T (NKT) 세포는 바운드 또는 CD1d에 의해 제시 glycolipids을 인식하기 위해 TCR을 사용합니다. CD1 제시한 lipids에 반응 T 세포는 면역과 전염병에 대한 보호 및 종양 제거에 참여하고 있습니다. 따라서, 식별 정화하고, CD1 – 반응 NKT 세포의 반응을 추적하는 능력은 매우 중요합니다. CD1d와 알파 Galactosyl ceramide (A – Galcer)의 tetramers의 세대는 NKT 세포의 생물학에 상당한 통찰력을하고 있습니다. 다른 CD1 분자로부터 만들어진 Tetramers도 생성되었으며 이러한 새로운 시약이 크게 지질 기반 백신에 대한 반응을 모니터링 잠재적인 사용과 면역 질병 및 기타의 진단에 지질 반응 T 세포의 기능의 지식을 확대 트리 트먼트.
Protocol
Discussion
이 절차에서는, 그것은, 시작 성장, 곤충 세포를 감염하고 이러한 세포를 사용하여 baculovirus를 titer하는 방법을하는 방법을 보여줍니다. 이 절차의 가장 중요한 측면은 세포의 유지 보수하고 baculovirus의 정확한 titer를 알고. 일단 CD1 tetramers를 생성, 그들은 glycolipid 반응 T 세포 분석을위한 강력한 도구로 사용할 수 있습니다. Baculovirus 시스템은 또한 MHC 클래스 II의 tetramers 때문에이 절차는 훨씬 광범위한 응용을 포?…
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Express Five SFM | Serum Free Medium | Invitrogen | 10486025 | |
| High Five TM | Insect Cells | Invitrogen | B855-02 | |
| Glutamine Pen strep | Antibiotics | Invitrogen | 10378-016 | |
| 25cm2 TC Flask | Plastic | Fisher | 10-126-28 | |
| 175 cm2 TC Flask | Plug seal flask | Fisher | 10-126-8 | |
| Erlenmeyer Flask | Cell Culture Flask | Fisher | 07 200 672 | |
| YM 30 Concenterator | 30,000 MWCO | Millipore | UFC 903096 | |
| FPLC equipment | GE Healthcare | |||
| BrA Enzyme and Buffer | Biotinylation Kit | Avidity | BIRA500 | |
| Ni-NTA Agarose Column | His Tag Protein Purification Column | GE Healthcare | ||
| Desalting column | To get Rod of Salt from Protein | GE Healthcare | ||
| MonoQ Column | Anion Exchange Chromatgraphy | GE Healthcare | ||
| S200 Column | Size Exclusion Chromatography | GE Healthcare | ||
| alpha-Galcer | Glycolipid | |||
| PE- Streptavidin | For conjugating Protein | Molecular Probe | S-866 |
References
- Benlagha, K., Weiss, A., Beavis, A., Teyton, L., Bendelac, A. In vivo identification of glycolipipd antigen-specific T cells using fluorecent CD1d tetramers. J. Exp. Med. 191, 1895-1903 (2000).
- Kinjo, Y., Wu, D., Kim, G., Xing, G. W., Poles, M. A., Ho, D. D., Tsuji, M., Kawahara, K., Wong, C. H., Kronenberg, M. Recognition of bacterial glycosphingolipids by natural killer T cells. Nature. 434, 520-525 (2005).
- Naidenko, O. V., Maher, J. K., Ernst, W. A., Sakai, T., Modlin, R. L., Kronenberg, M. Binding and antigen presentation of ceramide-containing glycolipids by soluble mouse and human CD1d molecules. J. Exp. Med. 190, 1069-1080 (1999).
- Porcelli, S. A. The CD1 family: A third lineage of antigen- presenting molecules. Adv. Immunol. 59, 1-98 (1995).
- Sidobre, S., Kronemberg, M. CD1 tetramers: A powerful tool for the analysis of glycolipid-reactive T cells. J. Immunol. 169, 1340-1348 (2002).
