Summary
यहाँ हम लंबे समय से लंबाई इलेक्ट्रोस्टैटिक प्रतिकर्षण-हाइड्रोफिलिक बातचीत क्रोमैटोग्राफी मिलकर मास स्पेक्ट्रोमेट्री (LERLIC-एमएस / एमएस) विधि का एक कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। यह एक उपन्यास पद्धति है कि बन्दूक प्रोटिओमिक्स द्वारा पहली बार परिमाणन और glutamine और asparagine deamidation isoforms की लक्षण वर्णन के लिए सक्षम बनाता है।
Abstract
प्रोटीन deamidation की विशेषता भूमिका (रों) और इस प्रोटीन posttranslational संशोधन (PTM) मानव विकृति और अन्य जैव रासायनिक संदर्भों में की क्षमता को समझने के लिए आवश्यक है। आदेश प्रोटीन deamidation के लक्षण वर्णन करने के लिए, हम हाल ही में एक उपन्यास लंबी लंबाई इलेक्ट्रोस्टैटिक प्रतिकर्षण-हाइड्रोफिलिक बातचीत क्रोमैटोग्राफी मिलकर मास स्पेक्ट्रोमेट्री (LERLIC-एमएस / एमएस) विधि है जो glutamine (Gln) और asparagine (Asn) isoform अलग कर सकते हैं विकसित किया है अत्यधिक जटिल जैविक नमूनों के लिए मॉडल यौगिकों से deamidation के उत्पादों। LERLIC-एमएस / एमएस इसलिए है, जुदाई और Gln deamidation isoforms की मात्रा के लिए पहली बन्दूक प्रोटिओमिक्स रणनीति। हम यह भी एक नई बात के रूप में, प्रदर्शित, कि नमूना प्रसंस्करण यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल LERLIC-एमएस / एमएस द्वारा अपने लक्षण वर्णन की इजाजत दी स्थिर succinimide मध्यवर्ती। इस वीडियो लेख में दिखाया गया है LERLIC-एमएस / एमएस के अनुप्रयोग वर्तमान में unknow स्पष्ट करने में मदद कर सकते हैंप्रोटीन deamidation की n आणविक सरणियों। साथ ही, LERLIC-एमएस / एमएस एंजाइमों की अभिक्रियाएं कि विशिष्ट जैविक पृष्ठभूमि में deamidation धरना के आगे समझ प्रदान करता है।
Introduction
Deamidation एक प्रोटीन posttranslational संशोधन (PTM) कि asparagine (Asn) और / या glutamine (Gln) अवशेषों 1 के संशोधन के माध्यम से प्रोटीन रीढ़ की हड्डी के लिए एक नकारात्मक चार्ज का परिचय है। 1 2 अनुपात: इस संशोधन Asn अवशेषों को प्रभावित करने, जबकि एक आम 3 पर समाजिक उत्पादों isoaspartic एसिड (isoAsp) और n -aspartic एसिड (एएसपी) उत्पन्न करता है। होते हुए भी, इस अनुपात मरम्मत एंजाइम एल isoaspartyl मिथाइल (PIMT) 3, 4 के हस्तक्षेप के द्वारा बदला जा सकता। इसी तरह, Gln अवशेषों की deamidation एक उम्मीद 1 पर समाजिक गामा glutamic एसिड (γ-ग्लू) और अल्फा-glutamic एसिड isoforms (α-ग्लू) उत्पन्न करता है: 7 अनुपात 3, 5, लेकिन इस अनुपात की कार्रवाई के द्वारा स्थानांतरित किया जा सकता हर जगह का एंजाइम transglutaminase 2 और अन्य transglutaminases, सहित transglutaminase 1, एक ईnzyme हाल ही में पहचान के रूप में मस्तिष्क 6 में बाह्य पुटिकाओं के साथ जुड़े।
Deamidation की उत्पत्ति पूर्व Gln अवशेषों जिसमें transglutaminases और अन्य एंजाइमों transamidation के माध्यम से अंतर / इंट्रा-आणविक तिर्यक मध्यस्थता पर विशेष रूप से आम है, या तो सहज या एंजाइमी हो सकता है (कई जीर्ण में और इसके निहितार्थ Gln transamidation पर अधिक जानकारी के लिए 3 देख सकते हैं और घातक मानव रोगों)। इसलिए, deamidation एक PTM संरचना पर एक महत्वपूर्ण प्रतिक्रिया और प्रभावित अणुओं 4, 7, 8 के समारोह है और इसके सेवा उम्र बढ़ने 9 के रूप में आणविक घड़ी सहित अपनी विभिन्न जैव रासायनिक परिणामों के प्रकाश में में गहराई से रासायनिक लक्षण वर्णन 3 की आवश्यकता है कि है ।
हालांकि Asn अवशेषों की deamidation कर दिया गया है अपेक्षाकृत नीचे-ऊपर बन्दूक प्रोटिओमिक्स द्वारा-वर्णन 1, 10, Gln अवशेषों की deamidation अभी भी इलेक्ट्रॉन आधारित कट्टरपंथी विखंडन 11 से मॉडल यौगिकों के चुनौतीपूर्ण विश्लेषण से परे एक उपयुक्त लक्षण वर्णन विधि नहीं है। हमने हाल ही में एक उपन्यास एक आयाम बन्दूक प्रोटिओमिक्स रणनीति (LERLIC-एमएस / एमएस) 3 कि एक विश्लेषण में जटिल जैविक नमूने और मॉडल यौगिकों से Gln और Asn deamidation isoforms की जुदाई में सक्षम बनाता है विकसित किया है। LERLIC-एमएस / एमएस एक लंबे समय से लंबाई (50 सेमी) आयन एक्सचेंज स्तंभ (LAX) इलेक्ट्रोस्टैटिक प्रतिकर्षण-हाइड्रोफिलिक बातचीत क्रोमैटोग्राफी (ERLIC) मोड पर काम का उपयोग कर पेप्टाइड्स tryptic पच की जुदाई पर आधारित है और मिलकर मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए युग्मित है (LC- एमएस / एमएस)। इस नई विश्लेषणात्मक रणनीति चिह्नित करने के लिए और अपेक्षाकृत मानव मस्तिष्क के ऊतकों में प्रत्येक deamidated अवशेषों की हद तक quantitate इस्तेमाल किया गया हैच "> 3। फिर भी, प्रोटोकॉल को यहां बताई LERLIC-एमएस / एमएस की वीडियो इमेजिंग ब्याज की जैव रासायनिक संदर्भ में प्रोटीन deamidation की विशेषताओं का अध्ययन करने के उद्देश्य से प्रदान करेगा।
नैतिकता कथन
इस प्रोटोकॉल के सभी प्रक्रियाओं सिंगापुर में नानयांग प्रौद्योगिकी विश्वविद्यालय की संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया है और संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार प्रदर्शन किया गया है।
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Protocol
1. पैकिंग लंबी लंबाई आयनों विनिमय (LAX) केशिका स्तंभ
(ध्यान दें: हालांकि LAX स्तंभ हो सकता है घर में के रूप में हम इस प्रोटोकॉल में वर्णन पैक, लैक्स कॉलम भी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, अधिक जानकारी के लिए सामग्री और अभिकर्मकों की तालिका देखें)।
- पैकिंग बफर (तालिका 1) घोल तैयार करने के लिए की 3.5 एमएल में कमजोर ऋणायन विनिमय पैकिंग सामग्री के 50 मिलीग्राम निलंबित करें।
- एक महिला-महिला फिटिंग, एक बच्चों को मारने की छड़ी और एक महिला अखरोट का उपयोग कर - केशिका स्तंभ (200 सुक्ष्ममापी आंतरिक व्यास (ID) ट्यूबिंग 50 सेमी लंबाई) के अंत इकट्ठा। एक स्क्रीन 1/16 "1 माइक्रोन के आयुध डिपो छेद के आकार महिला-महिला फिटिंग के अंदर जगह (नोट:। यहां इस्तेमाल किया स्क्रीन पैकिंग सामग्री के कण आकार की तुलना में छोटे छेद के आकार से सामग्री के रिसाव को रोकने के पास होना चाहिए स्तंभ)।
- घोल एक दबाव पंप 4,500 साई पर संचालित उपयोग करने के साथ केशिका पैक करें। (नोट: पैक Coluपैकिंग सामग्री तक एम.एन. स्तंभ की प्रविष्टि) में दिख रहा है।
- बिंदु 1.2 में वर्णित के रूप केशिका स्तंभ के दूसरे छोर इकट्ठा।
2. नमूना तैयार करना
यह प्रोटोकॉल मॉडल proteome के रूप में मानव मस्तिष्क के ऊतकों का विश्लेषण करने के LERLIC-एमएस / एमएस के आवेदन की रूपरेखा। (नोट: अन्य ऊतकों या प्रोटिओमिक नमूने का उपयोग करने के मामले में, नमूना तैयार करने की प्रक्रिया अनुकूलित किया जाना चाहिए।)
- ऊतक एकरूपता:
ए। धो मस्तिष्क के ऊतकों (50 से 100 मिलीग्राम) पांच मिनट में तीन बार के लिए 1x फॉस्फेट बफर समाधान के साथ।
ख। 1: 1 पर ऊतक Homogenize 2.5 ऊतक / धातु मोती / एसडीसी एकरूपता बफर (तालिका 2) अनुपात (w / w / v) 5 एक ऊतक homogenizer का उपयोग कर अधिकतम तीव्रता में सुरक्षित ताला ट्यूबों में 4 डिग्री सेल्सियस पर मिनट के लिए। (नोट: एसडीसी एकरूपता बफर प्रोटीज इनहिबिटर्स शामिल हो सकते हैं जैसा कि पहले 3 में किया है)
सी। ऊतक homogenate, इधर-उधर प्राप्त अपकेंद्रित्र10,000 × छ, 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पिछले चरण, m और एक नया 1.5 एमएल ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा।
घ। शेष छर्रों के लिए बीसी चरणों को दोहराएं और जब तक कोई गोली मनाया जाता है आवश्यक के रूप में कई बार के रूप supernatants गठबंधन। (नोट: यदि आप दो से अधिक बार बीसी चरणों को दोहराएँ है, तो centrifugation चरण के दौरान नमूना के नुकसान को रोकने के लिए एक नया सुरक्षित ताला ट्यूब के लिए नमूना और मोती ले जाते हैं)।
ई। Bicinchoninic एसिड परख (बीसीए) 12 के द्वारा प्राप्त homogenates के प्रोटीन एकाग्रता यों। - सोडियम deoxycholate (एसडीसी) मस्तिष्क homogenates के इन-समाधान tryptic पाचन 13 -assisted।
ए। 10 मिमी dithiothreitol (डीटीटी) प्राप्त homogenate के (शेयर समाधान तालिका 3 का समाधान 5 में संकेत का प्रयोग करके) प्रोटीन डाइसल्फ़ाइड बांड की कमी आरंभ करने के लिए की एक अंतिम एकाग्रता जोड़ें।
ख। एक स्नान में 30 मिनट के दौरान homogenate सेते60 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व निर्धारित।
सी। Homogenate के 20 मिमी iodoacetamide (आईएए) स्टॉक समाधान सारणी 4 के समाधान 7 में संकेत का उपयोग करने का एक अंतिम एकाग्रता जोड़ें।
घ। 45 मिनट के दौरान अंधेरे में कमरे के तापमान पर आईएए युक्त homogenate सेते हैं।
ई। मस्तिष्क homogenate दो परतों कमजोर पड़ने बफर का उपयोग कर (3 तालिका का समाधान 6) पतला।
च। 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के दौरान एक दूसरे कमी कदम के लिए नमूना सेते हैं।
जी। प्रोटीन करने वाली एंजाइम अनुपात 01:50 पर तालिका 2 का समाधान 2 में भंग अनुक्रमण ग्रेड-संशोधित ट्रिप्सिन जोड़ें (w / w)।
एच। 30 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात ऊष्मायन द्वारा ट्रिप्सिन साथ homogenate डाइजेस्ट।
मैं। चींटी एसिड (एफए) के 0.5% अंतिम एकाग्रता जोड़कर अगले दिन एंजाइमी पाचन बुझाने। (नोट: एफए का जोड़ अम्लीय परिस्थितियों में एसडीसी लवण की वर्षा का कारण होगा।)
ञ। धीरे एसडीसी precipi युक्त नमूने भंवरtates।
कश्मीर। 12,000 × छ, 10 मिनट के दौरान 4 डिग्री सेल्सियस नमूने centrifuging द्वारा एसडीसी लवण नीचे गोली।
एल। सतह पर तैरनेवाला लीजिए और एक साफ नया ट्यूब को तरल हस्तांतरण। (नोट: एसडीसी गोली से फिर से निलंबित नहीं है के लिए इस चरण की pipetting दौरान ध्यान रखना और / या इकट्ठा लवण।)
मीटर। 1 मिनट के लिए जोरदार vortexing के तहत एसडीसी फिर से भंग बफर (तालिका 5) में एसडीसी गोली फिर से भंग।
एन। चरणों को दोहराएँ दो बार उपजी पेप्टाइड्स की वसूली और supernatants गठबंधन करने के लिए जीएल। (नोट:। देखें सेरा एट अल पर अधिक जानकारी के लिए 2016 13 एसडीसी की मदद से इन-समाधान tryptic पाचन प्रोटोकॉल यहाँ अनुकूलित।) - tryptic की Desalting नमूने पच।
ए। एक 1g सी 18 कारतूस का उपयोग कर पचा नमूनों की desalting निष्पादित करें। (नोट: एक बड़ी मात्रा कारतूस (5 एमएल का उपयोग) प्रोटीन प्राप्त की गारंटी देता है के नमूनों में शेष एसडीसी लवण की उचित सफाई की राशि की स्वतंत्र रूप से पहलेLC-एमएस / एमएस इंजेक्शन करने के लिए।)
ख। acetonitrile के 5 एमएल (ACN) के साथ 1g सी 18 कारतूस की कंडीशनिंग निष्पादित करें।
सी। वातानुकूलित 1g सी 18 कारतूस द्वारा सफाई बफर (तालिका 6) 5 एमएल दर्रा किसी भी शेष कार्बनिक विलायक हटाने के लिए।
घ। 1g सी 18 कारतूस के लिए नमूना लोड करें।
ई। सफाई बफर के 5 एमएल हर कदम का उपयोग कर 1g सी 18 कॉलम में नमूने के 5 सफाई चरण - 3 निष्पादित करें।
च। क्षालन बफर के 5 एमएल (तालिका 7) का उपयोग कर 1g सी 18 कारतूस से desalted पेप्टाइड्स Elute।
जी। एक वैक्यूम सांद्रक में eluted पेप्टाइड्स सुखाएं।
सी। क्षालन बफर के 200 μL के अंतिम मात्रा में सूखे नमूना Reconstitute। (नोट:। उपयोग सशक्त और अवधि (> 10 मिनट) vortexing 30 मिनट के दौरान एक sonication स्नान में बाद sonication द्वारा पीछा करने के लिए पूरी तरह से पुनः निलंबित इंजेक्शन बफर में सूखे पेप्टाइड्स)
घ। LERLIC-एमएस / एमएस एना के लिए नमूने के इंजेक्शन की मात्रा समायोजित करें1 से 3 प्रोटीन की माइक्रोग्राम के बीच Lyze।
3. एक-आयाम LERLIC-एमएस / एमएस पृथक्करण
- तरल क्रोमैटोग्राफी की स्थिति:
मोबाइल चरणों:
एक: पानी में 0.1% एफए (तालिका 8)।
बी: 0.1% एफए ACN में (तालिका 9)
प्रवाह की दर: 0.4 μL / मिनट
स्तंभ: LAX केशिका स्तंभ (50 सेमी लंबाई - 200 सुक्ष्ममापी आईडी)
ए। 45 मिनट के लिए 3% बी - 434 मिनट के लिए 85% बी, 85 - - 522 मिनट के लिए 70% बी, 70 - 124 मिनट के लिए 35% बी, 35 से 40 मिनट, 95 के लिए 95% बी: निम्नलिखित 1200 मिनट-ढाल का प्रयोग करें , 5 मिनट के लिए 3% बी, 3 पर isocratic - 7 मिनट से अधिक 95% बी और 23 मिनट के लिए 95% बी में isocratic रखा।
ख। के रूप में सेरा और Gallart-पलाऊ एट अल में संकेत LAX केशिका का उपयोग कर पेप्टाइड्स की जुदाई निष्पादित करें। अति उच्च दबाव तरल क्रोमैटोग्राफी का उपयोग कर 3। - मास स्पेक्ट्रोमीटर विन्यास:
ए। डाटा अधिग्रहण बारी के मध्य प्रदर्शन करने के लिए स्कैन घटना का विवरण कॉन्फ़िगरएन पूर्ण फूरियर परिणत-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एफटी एमएस) और फूरियर परिणत-मिलकर मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एफटी एमएस / एमएस) निम्नलिखित मानकों के साथ:
A.1। डाटा अधिग्रहण मोड: सकारात्मक
A.2 एफटी एमएस पैरामीटर:
मास रेंज: 350 - 2,000 मीटर / z
संकल्प: 60,000
Microscans: 1 स्पेक्ट्रम प्रति
स्वचालित लाभ नियंत्रण: 1 × 10 6
A.3 एफटी एमएस / एमएस पैरामीटर:
विखंडन मोड: उच्च ऊर्जा collisional पृथक्करण (HCD)
A.4 मास रेंज: 150 - 2,000 मीटर / z
A.5 समाधान: 30,000
A.6 शीर्ष N आयनों: 10
Microscans: 1 स्पेक्ट्रम प्रति
चार्ज राज्य:> 2 +
अलगाव चौड़ाई: 2 दा
A.7 स्वचालित लाभ नियंत्रण: 1 × 10 6
ख। पेप्टाइड्स के मास स्पेक्ट्रोमेट्री का पता लगाने के लिए एक nanoelectrospray आयन 1.5 केवी पर काम स्रोत के साथ सुसज्जित एक Orbitrap जन स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग कर 3 में संकेत के रूप निष्पादित करें।
4. डेटा विश्लेषण
- prote प्रदर्शनLERLIC-एमएस / एमएस करने के लिए डेटाबेस खोज में एक विशिष्ट प्रोटिओमिक सॉफ्टवेयर का उपयोग कर निम्न पैरामीटर का उपयोग कर डेटा प्राप्त: (नोट: 3 अधिक जानकारी के लिए देखें।)
ए। आयन सहिष्णुता: 10 पीपीएम
ख। टुकड़ा आयन सहिष्णुता: 0.05 दा
सी। झूठी डिस्कवरी दर (एफडीआर): 1%
घ। डेटाबेस: UniProt मानव डेटाबेस
ई। फिक्स्ड संशोधन: Cys पर Carbamydomethylation
च। चर संशोधनों (यदि सॉफ्टवेयर के द्वारा आवश्यक): ऑक्सीकरण (मेट), Deamidation (Asn और Gln)। - आत्मविश्वास से लबरेज लक्षण वर्णन और LERLIC-एमएस / एमएस डेटा में समाजिक deamidated उत्पादों की मात्रा:
ए। निर्यात LERLIC-एमएस / एमएस से डेटाबेस खोज परिणामों के विश्लेषण के लिए एक spreedsheet सॉफ्टवेयर करने के लिए।
ख। ढूँढें और deamidated पेप्टाइड और उनके गैर deamidated समकक्षों की पूरी सूची निकालें।
सी। संदर्भ के रूप में प्राप्त पेप्टाइड्स की सूची का उपयोग करना, बड़े पैमाने पर सहिष्णुता की 5 पीपीएम पर एक उचित सॉफ्टवेयर का उपयोग कर इन पेप्टाइड्स के आयन chromatograms (XICs) निकालें। (ध्यान दें:XICs की निकासी के लिए इस्तेमाल किया सॉफ्टवेयर पर अधिक जानकारी के लिए 3 देखें।)
घ। दिखने में प्राप्त XICs निरीक्षण के रूप में इंगित 3 समाजिक उत्पादों की अलग डबल शिखर क्षालन की पहचान। (नोट: उन पेप्टाइड्स एमएस / एमएस स्तर पर पहचान आसानी से डेटाबेस खोज परिणाम में दो अलग-अलग प्रतिधारण बार की उपस्थिति द्वारा निर्देशित पाया जा सकता है की समाजिक उत्पादों।)
ई। प्रत्येक deamidated साइट / पेप्टाइड से समाजिक उत्पादों के सापेक्ष मात्रा प्राप्त XICs में प्रत्येक पहचान isomer के शिखर क्षेत्र के आधार पर प्रदर्शन किया गया है।
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Representative Results
Gln और Asn अवशेषों की Deamidation एक अपक्षयी प्रोटीन संशोधन (DPM) कई पुरानी और घातक रोगों 14 में फंसाया जाता है। यह प्रदर्शन किया गया है कि इस PTM मानव शरीर और इसी तरह के जैविक पृष्ठभूमि 1, 15 में एंटीबॉडी और अन्य अणुओं का आधा जीवन और degradative राज्यों भविष्यवाणी कर सकते हैं। प्रोटीन deamidation का महत्व है, वास्तव में, जैव चिकित्सा संदर्भ से परे चला जाता है, इसलिए इस संशोधन 16, 17 और कुछ अध्ययनों समय में deamidation की क्षमता का प्रदर्शन किया है चित्रों का सही डेटिंग प्रदर्शन करने के लिए विविध proteomes में मौजूद है और पुरातात्विक 18, 19 बनी हुई है । हालांकि महत्व और विविध पृष्ठभूमि में प्रोटीन deamidation की कार्यक्षमता लंबे समय के लिए की पुष्टि की गई है,फिर जिस तरह से इस PTM 3 के बारे में गहराई से लक्षण वर्णन प्राप्त करने के लिए पर तकनीकी अग्रिम की बहुत हाल ही में कमी जब तक था।
LERLIC-एमएस / एमएस 3 के अनुप्रयोग, चित्रा 1 में दिखाया गया के रूप में, पहली बार के लिए और Gln और Asn की एक एकल रन का समाधान जुदाई में प्रदान करता है deamidated जटिल proteomes या मॉडल से isoforms भी दिखा दो स्वतंत्र Asn और Gln deamidated उन पेप्टाइड्स के लिए यौगिकों proteoforms।
चित्र 1: शॉटगन प्रोटिओमिक्स द्वारा परिसर नमूने से पृथक्करण और Gln और Asp Deamidation उत्पाद की मात्रा के लिए LERLIC-एमएस / एमएस कार्यप्रवाह का आरेख। LERLIC-एमएस / एमएस प्रोटीन निष्कर्षण और पेप्टाइड्स के एक आयाम जुदाई से पहले नियंत्रण रेखा-एमएस / एमएस द्वारा एंजाइमी पाचन LAX केशिका स्तंभ का उपयोग शामिल है। एनाXICs की lysis deamidation समाजिक उनके विभिन्न अम्लता 3, 20, 21 के आधार पर अलग अलग प्रतिधारण समय पर eluted उत्पादों की पहचान की अनुमति। एमएस / एमएस deamidated और गैर deamidated पेप्टाइड और deamidated अवशेषों का पूरा भरोसा पहचान के बीच भेदभाव की अनुमति देता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
उलटे γ / α-glutamyl अनुपात (चित्रा 2) प्रदर्शित transamidation की enzymatically संशोधित मध्यवर्ती Gln अवशेषों का पर्दाफाश किया और LERLIC-एमएस / एमएस, न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों 3 में proteinopathy के अध्ययन पर महत्वपूर्ण प्रभाव हो सकता है, 22, 23 की विशेषता किया जा सकता है , 24। इसके अलावा, जैसा कि पहले सेरा और Gallart-पलाऊ 2016 में सूचना दी, कई अज्ञात PIMT सब्सट्रेट deamidated Asn अवशेषों में उलटे isoAsp / Asp अनुपात पेश प्रोटीन भी मानव ऊतकों में LERLIC-एमएस / एमएस 3 से पहचाना जा सकता।
चित्र 2: XICs और Deamidated पेप्टाइड्स के लिए एमएस / एमएस स्तर पर डबल रिटेंशन टाइम्स की पहचान का निरीक्षण महत्वपूर्ण एंजाइमों की अभिक्रियाएं कि Deamidation में जगह ले से Gln और Asn Deamidated Isomers और उत्पाद की पहचान की विशेषता की अनुमति दें। ए। मस्तिष्क प्रोटीन DPYL2 से पेप्टाइड FQMPDQGMTSADDFFEQ # जीटीके की γ / α-glutamyl आइसोमरों के लिए इसी दो चोटियों दिखा XIC का विस्तार dihydropyrimidinase संबंधित प्रोटीन 2. उल्टे γ / α-glutamyl अनुपात detecteकि पेप्टाइड में घ एक transglutaminase γ-glutamyl मध्यवर्ती के रूप में transglutamination प्रतिक्रिया में γ-glutamyl युक्त नकदी के संभावित निहितार्थ इंगित करता है। Deamidated अवशेषों दोनों प्रतिधारण समय पर एमएस / एमएस द्वारा सत्यापित किया गया था, बी। 389.1 मिनट पर α-glutamyl युक्त पेप्टाइड और ग के लिए इसी। 401.4 मिनट पर γ-glutamyl युक्त पेप्टाइड के लिए इसी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
इस पत्र की एक नवीनता के रूप में, हमने पाया है कि LERLIC-एमएस / एमएस succinimide मध्यवर्ती (चित्रा 3) के लक्षण वर्णन अनुमति देता है। नमूना प्रसंस्करण के दौरान हल्के अम्लीय pH के उपयोग succinimide में संशोधित Asn अवशेषों 25 मध्यवर्ती स्थिर। इसलिए, LERLIC-एमएस / एमएस succini की proteome चौड़ा अध्ययन की अनुमति देता हैmide मध्यवर्ती, महत्वपूर्ण शारीरिक और रोग निहितार्थ 26 के साथ एक अस्थिर और खराब समझ संशोधन।
चित्र 3: LERLIC-एमएस / एमएस द्वारा Asn अवशेष में succinimide इंटरमीडिएट की पहचान। ए। Asn के स्पेक्ट्रम मस्तिष्क प्रोटीन ALDO सी फ्रुक्टोज-बाइफोस्फेट से deamidated पेप्टाइड YASICQQN # GIVPIVEPEILPDGDHDLKR aldolase सी Deamidated अवशेषों Deam-Asn के रूप में दर्शाया गया है। ख। पेप्टाइड YASICQQN # GIVPIVEPEILPDGDHDLKR, जो इस मामले में कम से -17 दा के एक बड़े पैमाने पर बदलाव से पता चलता की स्पेक्ट्रम पहले से अमोनियम नुकसान कि succinimide मध्यवर्ती के गठन के दौरान जगह ले के कारण Asn अवशेषों (SCC-Asn) deamidated। वें का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंआंकड़ा है।
| अंग | 100 एमएल के लिए राशि |
| isopropanol | 90 एमएल |
| पानी | 10 एमएल |
तालिका 1. पैकिंग बफर रचना (90% isopropanol)।
| समाधान 1: अमोनियम एसीटेट के 1 एम। | |
| अंग | 50 एमएल के लिए राशि |
| अम्मोणिउम असेटट | 3.86 ग्राम |
| पानी (50 एमएल के लिए बना) | ~ 50 एमएल |
| समाधान 2: अमोनियम एसीटेट के 100 मिमी। | |
| अंग | 50 एमएल के लिए राशि |
| समाधान 1 | 5 एमएल |
| पानी | 45 एमएल |
| समाधान 3: 10% सोडियम deoxycholate। | |
| अंग | 1 एमएल के लिए राशि |
| सोडियम deoxycholate | 0.1 ग्राम |
| पानी | 1 एमएल |
| समाधान 4: एसडीसी एकरूपता बफर (100 मिमी अमोनियम एसीटेट युक्त 1% सोडियम deoxycholate)। | |
| अंग | 10 एमएल के लिए राशि |
| समाधान 2 | 9 एमएल |
| समाधान 3 | 1 एमएल |
तालिका 2. एसडीसी homogenization बफर संरचना (100 मिमी अमोनियम एसीटेट युक्त 1% सोडियम deoxycholate)। शेयर समाधान तैयार करेंअमोनियम एसीटेट के 1 एम (समाधान 1) और पतला के tion अमोनियम एसीटेट के 100 मिमी प्राप्त करने के लिए (समाधान 2)। इसके अतिरिक्त, 10% सोडियम deoxycholate का जायजा समाधान (समाधान 3) तैयार करते हैं। समाधान 4 में वर्णित के रूप में एसडीसी एकरूपता बफर तैयार करें।
| समाधान 5: 1 एम डीटीटी | |
| अंग | 10 एमएल के लिए राशि |
| dithiothreitol | 77 मिलीग्राम |
| समाधान 2 (तालिका 2 देखें) | 0.5 एमएल |
| समाधान 6: कमजोर पड़ने बफर | |
| अंग | 10 एमएल के लिए राशि |
| समाधान 5 | 0.1 एमएल |
| समाधान 2 (तालिका 2 देखें) | 9.9 एमएल |
तालिका 3. कमजोर पड़ने बफर संरचना (100 मिमी अमोनियम एसीटेट युक्त 10 मिमी dithiothreitol (डीटीटी))। 1 एम डीटीटी का जायजा समाधान (समाधान 5) तैयार करें और के रूप में समाधान 6 में दिए गए विवरण बाद में कमजोर पड़ने बफर तैयार करते हैं।
| समाधान 7: 1 एम आईएए | |
| अंग | 10 एमएल के लिए राशि |
| आईएए | 93 मिलीग्राम |
| समाधान 2 (तालिका 2 देखें) | 0.5 एमएल |
तालिका 4. Alkylation बफर संरचना (100 मिमी अमोनियम एसीटेट युक्त 20 मिमी iodoacetamide (आईएए))। 1 एम आईएए (समाधान 7) के शेयर समाधान तैयार करें।
| अंग | 50 एमएल के लिए राशि |
| अमोनियम हाइड्रॉक्साइड | 0.25 एमएल |
| पानी | 24.75 एमएल |
टेबल 5. एसडीसी Redissolving बफर संरचना (0.5% अमोनियम हाइड्रॉक्साइड)।
| अंग | 100 एमएल के लिए राशि |
| ट्री फ्लुओरो असेटिक अमल | 0.1 एमएल |
| पानी | 99.9 एमएल |
टेबल 6. क्लीन-अप बफर (0.1% trifluoroacetic एसिड)।
| अंग | 100 एमएल के लिए राशि |
| acetonitrile | 75 एमएल |
| फॉर्मिक एसिड | 0.1 एमएल |
टेबल 7. Elution बफर (75% Acetonitrile, 0.1% फार्मिक एसिड)।
| अंग | 1000 एमएल के लिए राशि |
| फॉर्मिक एसिड | 1 एमएल |
| पानी | 999 एमएल |
टेबल 8. मोबाइल चरण एक रचना।
| अंग | 1000 एमएल के लिए राशि |
| फॉर्मिक एसिड | <td> 1 एमएल|
| acetonitrile | 999 एमएल |
टेबल 9. मोबाइल चरण बी संरचना।
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Discussion
इस वीडियो को-लेख में हम LERLIC-एमएस / एमएस 3 के एक कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, एक विधि में गहराई से लक्षण वर्णन प्रदर्शन करने के लिए है और इसे सही प्रोटीन deamidation और एंजाइमी प्रक्रियाओं इस प्रोटीन संशोधन पर शामिल की सीमा निर्धारित करने के लिए। LERLIC-एमएस / एमएस इलेक्ट्रोस्टैटिक प्रतिकर्षण-हाइड्रोफिलिक बातचीत क्रोमैटोग्राफी (ERLIC) 27 के सिद्धांत के तहत एक लंबी लंबाई (50 सेमी) LAX के उपयोग पर आधारित है। एक लंबे समय से लंबाई स्तंभ के उपयोग, के रूप में हमारे अध्ययन 3 में दिखाया गया है, उनके समविद्युतविभव बिंदु 27 के अनुसार अलग पेप्टाइड्स के ERLIC की क्षमता बढ़ाता है।
LERLIC-एमएस / एमएस एक उपन्यास बन्दूक एक आयामी जुदाई रणनीति, एक कार्यप्रवाह कि नमूना प्रसंस्करण के दौरान समय-ऑन-हाथ की बचत होती है, हालांकि यह एक 1,200 मिनट ढाल के रूप में 3 में संकेत अत्यधिक जटिल proteomes पर इष्टतम परिणाम प्राप्त करने की आवश्यकता है प्रतिनिधित्व करता है। एक 60 मिनट gradienLERLIC-एमएस / एमएस में टी भी बन्दूक प्रोटिओमिक्स 3 में पहली बार मॉडल यौगिकों पर Gln deamidation isoforms की इष्टतम जुदाई हासिल कर सकते हैं। इन दो आवेदनों के आधार पर हम अनुमान है कि दूसरे आयाम जुदाई LAX केशिका द्वारा किया जाता बीच जटिलता के नमूनों का विश्लेषण करने के लिए एक बहुआयामी क्रोमैटोग्राफी दृष्टिकोण के तहत पहली बार एक आयाम रिवर्स चरण क्रोमैटोग्राफी के लिए युग्मित किया जा सकता है, एक कार्यप्रवाह पहले से हमारे समूह 10 द्वारा इस्तेमाल किया।
प्रोटीन deamidation के विश्लेषण के लिए नमूना तैयारी एक महत्वपूर्ण कदम है कि सावधान ध्यान देने की आवश्यकता काफी हद 1 पर Asn अवशेषों पर artefactual deamidation की घटना को रोकने के लिए है। हाओ एट अल। पाया गया कि हल्के अम्लीय pH के तहत tryptic पाचन काफी नमूना तैयारी 28 के दौरान artefactual deamidation के प्रेत से बचाता है। हम समाधान की कोशिश में हमारे एसडीसी की मदद से इस अध्ययन में इस्तेमाल किया हैptic पाचन 13, एक तरीका है जहाँ नमूना प्रसंस्करण पीएच 6. पर किया जाता है दूसरी ओर, मजबूत अम्लीय स्थिति जब पीएच की तुलना में कम 6 29 रखा है ट्रिप्सिन के पाचन क्षमता को चुनौती हो सकती है। इस मुद्दे को, बहुत हाल ही में लियू एट अल को संबोधित करते। एक इष्टतम पाचन रणनीति है कि पीएच 4.5 30 पर ग्लू-सी द्वारा ट्रिप्सिन प्रतिस्थापन सफल पाचन और Asn अवशेषों पर artefactual deamidation की घटना की रोकथाम के लिए अनुमति देता है सूचना दी है। पाचन विधि लियू एट अल द्वारा रिपोर्ट का क्रियान्वयन। 30 LERLIC-एमएस / एमएस द्वारा Asn deamidation विश्लेषण करने के लिए एक संभावित रणनीति है कि प्रयोगात्मक सत्यापन की आवश्यकता है हो सकता है।
प्रोटोकॉल इस वीडियो-लेख में रेखांकित एक महान क्षमता आगे की विशेषताएँ और वर्तमान में अज्ञात isoform अनुपात सरणियों कि उम्र बढ़ने और मानव रोगों में प्रोटीन deamidation की भागीदारी को परिभाषित quantitate गया है। फरthermore, अन्य जैविक पृष्ठभूमि में LERLIC-एमएस / एमएस के आवेदन क्षमता और एक आणविक घड़ी संशोधन के रूप में प्रोटीन deamidation के जोखिम को निर्धारित करने के लिए मदद मिलेगी।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
, सिंगापुर (NMRC-के-IRG-0003-2016), और NTU-NHG एजिंग रिसर्च ग्रांट के राष्ट्रीय चिकित्सा अनुसंधान परिषद (: इस काम के हिस्से में शिक्षा के सिंगापुर मंत्रालय (अनुदान ARC9 / 15 टीयर 2) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया अनुदान ARG / 14,017)। हमारा अनुरोध है हमें पैकिंग सामग्री है कि इस अध्ययन संभव बनाया के साथ प्रदान की के लिए डॉ एंड्रयू अल्पेर्ट और PolyLC टीम के लिए हमारी कृतज्ञता और सबसे दिली धन्यवाद व्यक्त करना चाहेंगे।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PolyCAT 3 µm 100-Å (bulk material) | PolyLC Inc. | Special order | |
| Long-length ion exchange capillary column 50 cm - 200 µm ID | PolyLC Inc. | Special order | |
| PEEKsil Tubing 1/16" OD x 200 µm ID x 50 cm length | SGE Analytical Science under Trajan Scientific Australia | 620050 | |
| Female-to-female fitting for 1/16" OD tubbing | Upchurch Scientific | UPCHF-125 | |
| Female nut for microferule | Upchurch Scientific | UPCHP-416 | |
| Microferule | Upchurch Scientific | UPCHF-132 | |
| Pressure Bomb NanoBaume | Western Fluids Engineering | SP-400 | |
| Shimadzu Prominence UFLC system | Shimadzu | Prominence UFLC | |
| Bullet Blender | Next Advance | BBX24 | |
| Safe-lock tubes | Eppendorf | T9661-1000EA | |
| Stainless steel beads. 0.9 – 2.0 mm. 1 lb. Non-sterile. | Next Advance | SSB14B | |
| Table-top centrifuge | Hettich Zentrifugen | Rotina 380 R | |
| Standard Digital Heated Circulating Bath, 120VAC | PolyScience 8006 6L | 8006A11B | |
| Sep-pack c18 desalting cartridge 50 mg | Waters | WAT020805 | |
| Vacumm concentrator | Eppendorf | Concentrator Plus System | |
| Dionex UltiMate 3000 UHPLC | Dionex | UltiMate 3000 UHPLC | |
| Orbitrap Elite mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific Inc. | ORBITRAP ELITE | |
| Michrom Thermo CaptiveSpray | Michrom-Bruker Inc. | TCSI-SS2 | |
| Incubator INCUCELL | MMM Group | INCUCELL111 | |
| Sequencing-grade modified trypsin | Promega | V5111 | |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 11836170001 (ROCHE) | |
| Phosphate buffer solution 10x (diluted to 1x) | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | A1542 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | i6125 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich | F0507 (HONEYWELL) | |
| Ammonium hydroxide | Sigma-Aldrich | 338818 (HONEYWELL) | |
| Acetonitrile HPLC grade | Sigma-Aldrich | 675415 | |
| Isopropanol HPLC grade | Sigma-Aldrich | 675431 | |
| Water HPLC grade | Sigma-Aldrich | 14263 |
References
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