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Developmental Biology

Induction de l'hypoxie dans les écrevisses vivantes de grenouille et de poisson zèbre

Published: June 26, 2017 doi: 10.3791/55710
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Physiology, Development and Neuroscience, University of Cambridge

Summary

Nous présentons un nouveau système de chambre hypoxique à utiliser avec des organismes aquatiques tels que des embryons de grenouille et de poisson zèbre. Notre système est simple, robuste, rentable et permet l'induction et le maintien en puissance de l'hypoxie in vivo et jusqu'à 48 h. Nous présentons 2 méthodes reproductibles pour surveiller l'efficacité de l'hypoxie.

Abstract

Ici, nous introduisons un nouveau système pour l'induction de l'hypoxie, que nous avons développé pour étudier les effets de l'hypoxie chez les organismes aquatiques tels que les embryons de grenouille et de poisson zèbre. Notre système comprend une chambre avec une configuration simple qui est néanmoins robuste pour induire et maintenir une concentration et une température d'oxygène spécifiques dans n'importe quelle solution expérimentale de choix. Le système présenté est très rentable mais très fonctionnel, il permet l'induction et le maintien en puissance de l'hypoxie pour des expériences directes in vivo et pour différentes périodes jusqu'à 48 h.

Pour surveiller et étudier les effets de l'hypoxie, nous avons utilisé deux méthodes: la mesure des niveaux de facteur 1alpha inducible à l'hypoxie (HIF-1α) dans des embryons entiers ou des tissus spécifiques et la détermination de la prolifération des cellules souches de la rétine par 5-éthynyl-2'- Incorporation de désoxyuridine (EdU) dans l'ADN. Les niveaux de HIF-1α peuvent servir de marqueur d'hypoxie générale dans l'ensemble de l'embryon ou du tissuDe choix, ici la rétine embryonnaire. L'incorporation d'EdU dans les cellules proliférantes de la rétine embryonnaire est une production spécifique d'induction d'hypoxie. Ainsi, nous avons montré que les progéniteurs de rétine embryonnaire hypoxique diminuent la prolifération dans les 1 h d'incubation sous 5% d'oxygène des embryons de grenouille et de poisson zèbre.

Une fois maîtrisé, notre installation peut être utilisée pour être utilisée avec de petits organismes modèles aquatiques, pour des expériences directes in vivo , une période de temps donnée et sous une concentration d'oxygène normale, hypoxique ou hyperoxyde ou sous tout autre mélange de gaz donné.

Introduction

La recherche sur l'hypoxie comporte de nombreuses applications. Il s'agit notamment d'enquêter sur la pathogenèse et de développer des traitements pour les affections médicales caractérisées par une hypoxie 1 et une maladie aiguë de haute altitude 2 . Le stress hypoxique entraîne des changements métaboliques majeurs chez tous les organismes nécessitant de l'oxygène. Le stress hypoxique influence également la croissance et le développement du fœtus et la pathogenèse de plusieurs maladies humaines, y compris la restriction de la croissance intra-utérine 3 . Le stress hypoxique peut non seulement entraîner une réduction du poids à la naissance, la mortalité du foetus et du néonatale, mais aussi entraîner de nombreuses complications dans la vie adulte, telles que les maladies cardiovasculaires, le diabète de type 2, l'obésité et l'hypertension 4 . Le stress hypoxique est également souvent observé lors du développement de la tumeur solide, lorsque le tissu tumoral dépasse son apport sanguin. Il est donc crucial de pouvoir étudier les effets de l'hypoxie in vivo et directement pendant l'embryon Développement yonique.

Parmi les méthodes les plus connues qui ont été utilisées pour étudier les effets de l'hypoxie au cours du développement, il y a l'utilisation de chlorure de cobalt dans le milieu de croissance ou l'incubation de l'organisme dans une chambre hypoxique. Le chlorure de cobalt induit artificiellement une réponse hypoxique sous une concentration normale d'oxygène, en raison de son rôle dans la stabilisation du facteur 1 inducible par l'hypoxie (HIF-1α) en empêchant sa dégradation protéosomale 5 , 6 , 7 . Cependant, étant une méthode pratique 8 , l'utilisation de chlorure de cobalt ainsi que d'autres mimétiques d'hypoxie chimique similaires peut avoir un effet délétère non spécifique sur les cellules et les tissus, par exemple , l'apoptose 9 . Par conséquent, les chambres hypoxiques sont une meilleure méthode pour l'induction de «l'hypoxie naturelle» dans les organismes vivants au cours du développement normal.

Nous nous sommes concentrés sur le développement d'un système d'induction de l'hypoxie chez les embryons d'animaux aquatiques. Les grenouilles et le poisson zèbre sont devenus des organismes modèles informatifs à base de vertébrés pour des études sur de nombreux processus biologiques, ainsi que des modèles pour diverses maladies humaines. Se développent à l'extérieur, éliminant la complication de la compensation maternelle. En outre, un développement rapide permet de manipuler les facteurs environnementaux et d'observer les changements phénotypiques dans la formation des organes en temps réel. En outre, de nombreux composants des voies principales de transduction du signal sont fortement conservés Ces organismes modèles et ont été caractérisés en détail par une large littérature. Le principal avantage de l'utilisation de grenouilles et d'embryons de poissons zèbres pour étudier les effets de l'hypoxie sur le développement des vertébrés est que tous les processus peuvent être surveillés directement, car l'oxygène pénètre rapidement dans les embryons. Ainsi, dans les grenouilles et le poisson zèbre, contrairement aux autres organismes modèles tels queEmbryons de souris, l'influence d'une concentration d'oxygène spécifique peut être étudiée dans le tissu d'intérêt, sans tenir compte de la présence ou du manque de système vasculaire fonctionnel.

La plupart des configurations disponibles dans le commerce pour l'incubation hypoxique présentent l'inconvénient d'être relativement importantes et d'avoir des coûts de fonctionnement élevés. Outre leur coût initial élevé et leur consommation de gaz, l'équilibrage et l'entretien des chambres communes d'hypoxie nécessitent un maintien de l'atmosphère hypoxique constante contre le gradient de gaz qui se produit naturellement dans ces chambres en raison de leur plus grande taille et / ou de leur respiration. Cela nécessite l'emploi de ventilateurs à gaz et un système de refroidissement, ce qui augmente la quantité d'équipement nécessaire supplémentaire, entrave la dextérité du chercheur et diminue globalement la simplicité de la procédure expérimentale. En revanche, la configuration que nous présentons ici est relativement robuste mais très rentable, petite, facile à établir et permet fÉquilibre économique des gaz, atmosphère hypoxique stable et échange simple de matériaux et de solutions dans la chambre. Notre système peut être utilisé pour être utilisé avec n'importe quel organisme modèle aquatique d'intérêt.

Nous avons construit une chambre hypoxique qui est commodément petite et donc peut être placée dans un incubateur de laboratoire commun, ce qui permet facilement des procédures expérimentales à n'importe quelle température spécifique. Offrant un contrôle pratique de la température ainsi que de la concentration d'oxygène dans le milieu, l'avantage de notre système contre les incubateurs d'hypoxie disponibles dans le commerce réside dans sa petite taille et son rapport coût-efficacité. Ainsi, notre configuration peut être établie en utilisant des fournitures de laboratoire générales disponibles pour la majorité des laboratoires de recherche et ne nécessite aucun matériau coûteux. En outre, notre installation ne génère pas de chaleur, contrairement aux incubateurs d'hypoxie disponibles dans le commerce, et permet une utilisation à des températures inférieures à la température ambiante placées dans un incubateur. La laSt est particulièrement critique pour le travail avec des organismes à sang froid tels que les grenouilles et les poissons où les taux de développement et métabolisme dépendent fortement de la température.

Étant très rentable et facilement construit, notre chambre d'incubation de gaz est néanmoins très polyvalente dans l'établissement de diverses conditions hypoxiques ou hyperoxiques, tout en permettant une administration rapide et facile de différents supports et solutions pour un grand nombre de conditions expérimentales. En outre, en utilisant une plaque de 24 puits au lieu des plats couramment utilisés ou des réservoirs de laboratoire 10 , 11 , 12 , notre système permet l'observation et le traitement expérimental de plusieurs conditions mutantes à la fois.

Pour contrôler l'induction correcte de l'hypoxie, nous avons surveillé les niveaux de la protéine HIF-1α par détection Western Blot. En outre, le nombre de cellules proliférantes avant et après incubationN dans la chambre hypoxique peut être utilisé pour déterminer si l'hypoxie a été induite dans le tissu. Cette méthode est basée sur nos résultats précédemment publiés 13 , montrant que la prolifération du nerf embryonnaire de cellules souches rétiniennes diminue lors de l'induction de l'hypoxie. Ainsi, nous avons surveillé le niveau de prolifération des cellules souches de la rétine en ajoutant de la 5-éthynyl-2'-désoxyuridine (EdU) au milieu embryonnaire et en mesurant son incorporation dans l'ADN des cellules nouvellement proliférantes.

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Protocol

Ce protocole suit les lignes directrices sur les soins des animaux de l'Université de Cambridge.

1. Entretien des animaux

  1. Embryons de grenouille
    REMARQUE: Les embryons peuvent être élevés et entretenus selon les installations animales et de laboratoire. Ici, un exemple de maintenance animale est décrit.
    1. Préparer une solution de solution Barth Solution (MBS) de 0,1 x: NaCl 0,88 mM, KCl 10 uM, NaHCO 3 24 u, HEPES 100 uM, MgS04 8,2 μM, Ca (NO 3 ) 2 , 3,3 μM et CaCl2 4,1 μM, pH 7,6 .
    2. Obtenir des embryons Xenopus laevis par fertilisation in vitro .
      1. Induire l'ovulation chez les femmes adulte des grenouilles griffonnées africaines ( Xenopus laevis) par injection avec une gonadotrophine sérique enceinte enceinte une semaine (60 UI) et 12 h (500 UI) avant la ponte.
      2. Recueillir des ovocytes et les fertiliser in vitro avec un testicule masculin homogénéisé.
      3. RaiSe embryons dans 0,1x MBS à 16 - 18 ° C. Etape des embryons selon la table normale de Xenopus laevis 14 . Prenez soin de choisir des embryons entiers et vivants pour l'expérience.
  2. Embryons de poisson zèbre
    REMARQUE: Les embryons peuvent être élevés et entretenus selon les installations animales et de laboratoire. Ici, un exemple de maintenance animale est décrit.
    1. Préparer un milieu embryonnaire: NaCl 5 mM, KCl 0,17 mM, CaCl2 0,33 mM, MgS04 0,33 mM et 0,001, 00001 de bleu de méthylène.
    2. Maintenir et élever WT AB souche Danio rerio à 26,5 ° C.
    3. Collectez les embryons le matin de la fécondation, augmentez jusqu'à 4 jours après la fertilisation (dpf) à 28 ° C dans un milieu embryonnaire préparé comme décrit ci-dessus, sélectionnez et étape comme décrit précédemment 15 .

2. Induction de l'hypoxie in vivo

  • Construction de la chambre d'incubation de gaz
    1. Utilisez un réservoir aquatique d'élevage ( Figure 1A ) qui est normalement utilisé dans l'installation de poisson pour la construction de chambre hypoxique. Ce réservoir doit être équipé d'une plaque à 24 puits.
    2. Préparez une plaque de 24 puits en filet comme illustré à la figure 1 . Retirez le fond en plastique de la plaque à 24 puits ( Figure 1B ), par exemple en utilisant une fraiseuse à cet effet.
    3. Remplissez l'espace entre le plastique des puits et les parois de la plaque avec de la résine époxy. Fixez tout filtre en nylon ( Figure 1C ) avec un diamètre de maille de 0.1-0.2 mm au plastique revêtu de résine et laissez la plaque complètement sèche.
    4. Une fois sec, percez trois ou quatre tunnels ( figure 1D ) de 10 mm de longueur et 5 mm de diamètre dans les parois de la plaque en résine et en maille. Fixez des tiges en plastique ou téflon( Figure 1E ) de diamètre approprié et 30 mm de longueur aux tunnels et placez la plaque dans le réservoir de choix.
    5. Placez la plaque à fond de filet de 24 puits dans le réservoir aquatique de choix. À l'aide de tubes en silicone ( Figure 1F ), fixez un réservoir de gaz ( Figure 1G ) avec le mélange souhaité O 2 / N 2 ou un autre mélange gazeux de choix avec une soupape de distribution ( Figure 1H ) en utilisant un régulateur de gaz approprié (I) (BOC 200 bar). Ici, utilisez des réservoirs de gaz contenant un mélange de 5% d'oxygène et 95% de N 2 dans les expériences d'hypoxie présentées ici.
    6. Réglez le débit d'oxygène dans le milieu de la chambre à 0,0017-0,0019 mètres cubes par seconde. Sous ce débit de gaz, aucune perturbation du milieu ne doit être observée dans les puits de la plaque.
      1. Utiliser le régulateur de gaz à deux étapes à haute pureté à cette fin. Réglez le régulateur pour réduire la pression intérieure deE tank de gaz (1000 - 2500 PSI) à une pression de livraison de 10 PSI tout au long de l'expérience. Ainsi, conformément aux spécifications de ce régulateur de gaz, un débit de 0,00189 mètres cubes par seconde a été réalisé tout au long de l'expérience.
    7. Connectez le tube en silicone et la vanne de distribution à un diffuseur de disque en céramique ( Figure 1J ) à l'intérieur du réservoir aquatique. Fermez le réservoir aquatique et retirez soigneusement le couvercle, en le recouvrant avec de la graisse de silicone ( Figure 1K ) (comparez avec la Figure 1 ). Si une température non ambiante particulière est requise, placez la chambre hypoxique dans un incubateur de laboratoire de la température requise.
    8. Selon le type d'embryons utilisé dans l'expérience, remplissez le réservoir de chambre hypoxique avec le milieu d'embryon approprié et commencez à diffuser le mélange de gaz à travers le diffuseur de disque en céramique. Equilibrer pendant 10-15 min.
    9. Après équilibrage avecLe mélange désiré d'oxygène, mesure la concentration d'oxygène dans l'eau à l'aide d'un oxymètre ou d'une sonde à oxygène. Ici, utilisez un oxymètre avec l'oxyde dissolvé à fibre optique et le capteur de température à cette fin.
  • Induction de l'hypoxie chez les embryons
    1. Sélectionnez soigneusement les embryons pour l'expérience, utilisez des embryons entiers et vivants pour l'incubation de l'hypoxie. Ici, les embryons de grenouilles de l'étape 38 ou des embryons de poissons zèbres 4 dpf dans les expériences présentées ici.
    2. Placez les plats d'embryon dans l'incubateur ( Figure 1K ) contenant la chambre d'incubation de gaz et laissez-les équilibrer à la température de l'incubateur.
    3. Transférer soigneusement les embryons dans les puits de la plaque maillée à 24 puits ( Figure 1B ) de la chambre d'incubation gazeuse, en utilisant une pipette en plastique. Utilisez toujours une pipette en plastique pour le transfert d'embryon tout au long du protocole.
      NOTE: Chaque puits de cette assiette peut contenir jusqu'àÀ 5 embryons de grenouilles de stade 38 ou jusqu'à 7 embryons de poisson zèbre de 4 dpf. Étiquetez les puits soigneusement si vous utilisez différents génotypes.
    4. Maintenir la chambre d'incubation gazeuse sous une infusion constante avec le mélange gazeux de choix pendant 5 h ou pour un temps plus long adapté à l'expérience. Utilisez un mélange de 5% O 2 et 95% de N 2 ici.
    5. Transférer soigneusement les embryons de la chambre d'incubation du gaz au milieu normoxique correspondant au type d'embryon et procéder immédiatement aux étapes 3 ou 4.
    6. Si un autre traitement normoxique est nécessaire, transférer soigneusement les embryons vers le milieu normoxique correspondant au type d'embryon.

    • 3. Contrôle de l'induction de l'hypoxie réussi en surveillant les niveaux HIF-1α

    1. Les préparatifs
      1. Préparer une solution MS222 0,4 mg / ml dans 0,1% de MBS.
      2. Préparer un tampon d'homogénéisation: Acheter un tampon de dosage de radioimmunoprécipitation (RIPA bUffer) pour l'homogénéisation des tissus et compléter la quantité de tampon nécessaire pour votre expérience avec Inhibiteur de protéase à une concentration finale de 1: 100 v / v.
      3. Préparez des solutions pour Western Blot.
        1. Préparer le tampon de chargement 4x Laemmli gel: Tris 425 mM pH 8,0, 40% v / v Glycerol, SDS 8% v / v, 4% v / v de bêta-mercaptoéthanol, 0,5% p / v Bromophénol Bleu, 10 ml volume total ddH 2 O.
        2. Préparer 5x tampon de course: 15 g de base de Trizma, 72 g de glycine, 5 g de SDS, volume total de 1 L ddH 2 O.
        3. Préparer le tampon de transfert: 2,66 g de base de Trizma, 14,4 g de glycine, 200 ml de methanol à 100%, volume total de 1 litre ddH 2 O.
        4. Préparer 10x TBST: 5 mL de Tris 1 M pH 8,0, 30 ml de NaCl 5M, 2,5 mL de Tween 20, 1 L de volume total H 2 O.
        5. Préparez la solution de blocage: 4% en poids de poudre de lait écrémé en 1x TBST.
    2. Collection de tissu
      1. Anesthésier les embryons en se baignant dans une solution MS222 à 0,4 mg / ml16 , 17 et les transférer dans un tube de réaction plastique rempli de tampon d'homogénéisation à l'aide d'une pipette en plastique. Utilisez 20 μL de tampon par embryon. Notez qu'au moins 5 embryons de grenouilles de stade 38 ou 7 embryons de poisson zèbre de 4 dpf sont nécessaires pour déterminer un changement significatif dans les niveaux de protéine HIF1α.
      2. Homogénéiser le tissu en utilisant un homogénéisateur de tissu approprié ou un sonicateur. Enlever les débris par centrifugation (15 min, 13 000 xg, 4 ° C).
        1. Alternativement, disséquer les rétines des embryons de grenou anesthésiés 17 et homogénéiser comme ci-dessus. Utiliser 20 μL de tampon d'homogénéisation pour 10 rétinas.
      3. Prendre le surnageant à l'aide d'une pipette, décomposer à 85 ° C pendant 5 minutes et compléter avec du tampon de chargement de gel Laemmli jusqu'à une concentration finale de 1x v / v ( par exemple , ajouter 5 μL de tampon 4x Laemmli à 15 μL d'homogénat). Utilisez ce surnageant pour le WesTromper ou congeler les échantillons à -20 ° C.
    3. Western Blot
      1. Chargez les échantillons préparés comme décrit à l'étape 3.2 sur un gel préfabriqué à 12% dans un système d'électrophorèse en utilisant un tampon de course 1x v / v. Utiliser une échelle de protéines pour la détermination de la taille des protéines. Transférer les protéines sur une membrane de nitrocellulose (membrane de 0,45 μm) dans le tampon de transfert pendant 1 h emballé sur de la glace à 4 ° C selon le protocole du fabricant.
      2. Bloquer les sites de liaison non spécifiques en incubant la membrane dans un tampon de blocage pendant 60 minutes. Suivre avec 3 x 10 minutes de lavage dans 1x TBST.
      3. Incuber la membrane dans des solutions d'anticorps anti-HIF-1α de lapin et anti-α-tubuline de souris diluées 1: 100 v / v et 1: 5000 v / v, respectivement, dans une solution de blocage, pendant 2,5 h à la RT. Suivre avec 3 x 10 minutes de lavage dans 1x TBST.
      4. Pour la détection, incuber dans des anticorps conjugués anti-lapin et chèvre anti-souris HRP dilués 1: 1000 v / v dans la solution de blocage pendant 1 h.Suivre avec 3 x 10 minutes de lavage dans 1x TBST et visualiser la coloration HRP en utilisant un kit commercial et une machine de développement de choix.
      5. Quantifier la quantité de protéine HIF1α en utilisant la quantification numérique.

    4. Surveillance de la prolifération cellulaire dans l'hypoxie

    1. Les préparatifs
      1. Préparez une solution EdU 5 mM dans le milieu embryonnaire de choix. La solution peut être utilisée immédiatement ou en aliquote et stockée à -20 ° C pendant jusqu'à 6 mois.
      2. Préparez la solution salée tamponnée au phosphate (PBS) ou achetez PBS à partir de ressources commerciales. Autoclave pendant 10 min à 115 ° C.
      3. Préparez des solutions pour la détection de l'incorporation d'EdU.
        1. Préparer une solution de fixation: 4% v / v de solution mère de Formaldéhyde à 16% dans du PBS.
        2. Préparer la solution de saccharose: 30% p / v de saccharose dans du PBS.
        3. Préparez PBST: 0,1% v / v de Triton X-100 dans du PBS.
        4. Préparer la solution de blocage: 10% v / v Sérum de chèvre inactivé par la chaleur (HIGS) dans PBST.
        5. Préparer la solution DAPI: 1: 1000 v / v 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) dans PBST.
    2. Incubation d'embryons dans l'hypoxie pour l'incorporation d'EdU
      1. Remplir la chambre d'incubation de gaz avec 400 à 500 ml d'une solution EdU 5 mM additionnée de DMSO à 1% v / v. Pré-équilibrer la solution avec le même mélange de gaz utilisé dans l'expérience pendant 15 minutes avant l'expérience. Notez que le volume de la solution d'incubation peut être minimisé en attachant des tiges plus courtes ( Figure 1E ) à la plaque de fond de maille.
      2. Raccorder le tube de gaz à la bouteille de gaz contenant un mélange gazeux de 5% O 2 et 95% de N 2 . Incuber la solution pendant 15 min.
      3. Transférer les embryons dans la chambre hypoxique, en les répartissant uniformément entre les puits et incuber pendant 2 h. Chaque puits peut accueillir jusqu'à 5 embryons de grenouilles de stade 38 ou jusqu'à 7 embryons de poisson zèbre 4 dpf.
      4. Analyser l'embryonS pour l'incorporation d'EdU.
    3. Temps d'incubation de l'embryon dans l'hypoxie et l'incorporation d'EdU
      1. Remplissez la chambre d'incubation de gaz avec 500 ml de milieu embryonnaire de choix. Connectez le tube de gaz à la bouteille de gaz contenant un mélange gazeux de 5% O 2 et 95% de N 2 et équilibrez le milieu avec le mélange gazeux pendant 15 min.
      2. Transférer les embryons dans la chambre hypoxique, en les répartissant uniformément entre les puits et incuber pour une période de temps souhaitée jusqu'à 48 h. Pendant les 1 h dernières heures, remplacer le milieu embryonnaire par une solution EdU 5 mM additionnée de DMSO à 1% v / v.
      3. Transférer les embryons vers le plat normoxique et analyser l'incorporation d'EdU.
    4. Détection et analyse d'incorporation d'EdU
      1. Anesthésier les embryons en se baignant dans une solution MS222 à 0,4 mg / ml.
      2. Transférer les embryons dans un flacon de verre approprié et le réparer en incubant dans la solution de fixation pendant 2 haT RT ou O / N à 4 ° C. Suivre avec 3 x 10 minutes de lavage dans PBS. Transférer soigneusement les embryons à la solution de saccharose pour la cryoprotection tissulaire. Incuber pendant 4 h ou jusqu'à ce que les embryons tombent au fond du flacon en verre.
      3. Incorporer les embryons en milieu d'incorporation (composé de température de coupe optimal). Des blocs de cryosection avec des embryons immédiatement ou conservez jusqu'à 14 jours à -80 ° C.
      4. Cryosection des blocs contenant des embryons à l'aide d'un cryostat. Collectez des sections d'épaisseur de 12 μm (embruns de poissons zèbres) ou 16 μm (embryons de grenouille) sur des lames de microscope et laissez sécher. Traitez les criosections immédiatement ou rangez-les à -20 ° C pendant 3 mois maximum.
      5. Détecter l'incorporation d'EdU par coloration immunofluorescente à l'aide d'un kit de chimie commerciale. Préparez la quantité de mélange de réaction EdU nécessaire pour le nombre de criosections dans l'expérience, tel que décrit par le fabricant.
        1. Pour 500 μL de mélange de réaction EdU, utilisez 430 μL de tampon de réaction EdU 1X, 20 μL de CuSO 4 , 1,2 μl d'azote d'Alexa Fluor, 50 μL d'additif tampon 1U EdU.
      6. Lavez les cryosections une fois avec PBS pour enlever le milieu d'encastrement et 3 x 5 min avec PBST pour perméabiliser le tissu. Incuber les criosections dans la solution de blocage pendant 30 min.
      7. Incuber les criosections avec le mélange de réaction EdU pendant 1 h et suivre 3 x 10 minutes de lavage dans le PBST. Costain les criosections avec la solution DAPI pendant 15 min, suivie de 3 x 10 minutes de lavage dans PBST. Monter les diapositives avec des cryosections colorées en milieu de montage, couvrir avec des lamelles et laisser sécher avant d'analyser sous un microscope fluorescent ou stocker à 4 ° C jusqu'à 1 an.
      8. Analyser les criosections avec une coloration anti-EdU sous un microscope à balayage confocal inversé et déterminer le nombre de cellules positives à EdU en utilisant la quantification numérique.

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    Representative Results

    L'utilisation du système de chambre hypoxique que nous présentons ici permet d'étudier les effets de l'hypoxie individuellement et in vivo chez les animaux vivants entiers. L'hypoxie peut être induite en plaçant des embryons entiers de grenouille ou de poisson zèbre dans la chambre hypoxique ( figure 1 ), et être entrepris sur différentes combinaisons de conditions. Une image de notre configuration complète de la chambre à gaz est illustrée à la figure 2 . Nous avons surveillé la concentration d'oxygène dans le milieu d'incubation à l'aide d'un capteur d'oxygène à fibre optique (2.1.9) à différents moments de l'expérience. Ces données indiquent que nous avons induit une hypoxie stable (6-6,5% d'oxygène dissous) au cours de nos expériences ( tableau 1 ).

    Tout d'abord, nous avons évalué les niveaux omniprésents et rétiniens du HIF-1α dans la normoxie et dans l'hypoxie induite dans notre chambre hypoxique. HIF-1αEst une protéine stabilisée sous de faibles concentrations d'oxygène. Nous avons mesuré les niveaux de HIF-1α dans les lysats d'embryons de grenouille entière maintenus sous une concentration normale d'oxygène ou soumis à une hypoxie de 5% et dans des lysats de leurs rétines isolées. Comme le montre la figure 3 , HIF-1α est stabilisé sous hypoxie dans les embryons entiers et dans les rétines. La stabilisation de HIF-1α est obtenue dans différents puits de la plaque d'incubation à fond de maille ( Figure S1 ).

    Comme nous l'avons déjà montré, l'hypoxie affecte la prolifération des progéniteurs de cellules souches rétiniennes dans la zone marginale ciliaire (CMZ) de la rétine 13 . Ainsi, le suivi de la prolifération dans le CMZ au moyen de l'incorporation d'EdU est un bon marqueur pour l'induction réussie de l'hypoxie. Nous avons incubé des embryons dans une chambre hypoxique maintenue à 5% d'oxygène et avons évalué la prolifération de la rétine comme décrit à l'étape 4.2. Comme prévuLes rétinas de contrôle normoxique ont montré une coloration EdU intense dans le CMZ, où les progéniteurs proliférants résident à la fois en grenouille ( figures 4B et 4D ) et en embryons de poissons zèbres ( figures 5A et 5C ). Après la privation d'oxygène dans la chambre hypoxique, une forte diminution de la prolifération des progéniteurs CMZ a été observée à la fois dans les embryons de grenouille ( figures 4C-4D ) et de poissons zèbres (figures 5B, 5C). Pour déterminer l'ampleur de l'effet, nous avons effectué un cours, en incubant les embryons dans une chambre hypoxique pour des périodes plus longues allant jusqu'à 24 h, en surveillant la prolifération par incorporation d'EdU comme décrit à l'étape 4.3. Nous pourrions montrer que la diminution de la prolifération des progéniteurs de la rétine était aiguë et la plus élevée en 2 h et a persisté pendant plusieurs heures ( Figure 4D ), alors que les embryons se développaient normalement selon leur stade de développement. Ce résultat suggère que notre système peut induire efficacement l'hypoxie dans une cible tiD'intérêt, après de courts temps d'incubation et de maintenir ces conditions pendant des périodes plus longues tout en soutenant le développement normal de l'embryon.

    Figure 1
    Figure 1: Représentation schématique de la configuration expérimentale de la chambre à gaz. ( A ) élevage du réservoir aquatique (22 (longueur) x 10,5 (largeur) x 10,5 cm (hauteur)) ( B ) plaque de 24 puits en filet (12,8 x 8,6 x 1,7 x 1,5 cm de diamètre de puits) ( C ) nylon Filtre avec un diamètre de maille de 0,1-0,2 mm ( D ) tunnels de 10 (longueur) x 5 mm (diamètre) ( E ) Téflon ou tiges en PVC de diamètre approprié et 30 mm de longueur ( F ) tubulure de silicone ( G ) réservoir de gaz avec La soupape de distribution souhaitée de l'oxygène / CO 2 ( H ) ( I ) vanne de gaz ( J ) cerAmic disque diffuseur ( K ) couvercle du réservoir. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

    Figure 2
    Figure 2: Une image de la configuration expérimentale de la chambre à gaz. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

    Tableau 1
    Tableau 1: Mesure de la concentration d'oxygène lors de différents temps d'incubation dans la chambre à gaz. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce f Igure.

    figure 3
    Figure 3: Les niveaux de HIF-1α augmentent lors de l'induction de l'hypoxie dans les embryons de Xenopus et leurs rétines. Les transferts de Western des lysats de protéines à partir d'embryons entiers ( A ) ou de rétines embryonnaires isolées ( B ) sont conservés sous des concentrations normales d'oxygène ou dans une hypoxie. Des taches ont été sondées pour la sous-unité HIF-1α et l'α-tubuline. Au moins 5 embryons ou 22 rétinas ont été prélevés pour chaque condition ( n = 5) ( C, D ) Quantification du Western blot effectué dans ( A, B ), respectivement. Les niveaux de protéines de HIF-1α ont été normalisés aux niveaux de protéines de l'α-tubuline. Les barres d'erreur représentent les écarts types entre les expériences. * P -value <0.05, *** p -value <0.001; N = 5.D / 55710 / 55710fig3large.jpg "target =" _ blank "> Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

    Figure 4
    Figure 4: L'hypoxie diminue la prolifération des progéniteurs dans la niche rétinienne des embryons de grenouille. ( A ) Représentation schématique d'une coupe transversale à travers une rétine Xenopus à 38 étages, indiquant la position de l'incorporation EdU de la zone marginale ciliaire (CMZ) ( B , C ) mesurée après une impulsion EdU de 2 h dans les rétines colorées au DAPI à partir de l'étape 38 Les embryons de grenouille sont conservés sous la normoxie ( B ) ou dans la chambre hypoxique ( C ). Magenta = tache DAPI; Gris = tache EdU. Barres d'échelle = 50 μm ( D ) Quantification de l'expérience réalisée en B et C. Les barres d'erreur représentent les écarts-types. *** N = 7. Pour chaque état, 10-15 réticines ont été quantifiées ( G ) Quantification de cellules positives à l'EdU après une incorporation d'EdU de 1 h dans les rétines des animaux après plusieurs fois par hypoxie (temps en minutes indiqué sur l'axe des abscisses). Les barres d'erreur représentent des écarts types de deux expériences indépendantes ( n = 2). Pour chaque condition et point de temps, un minimum de 10 rétinas a été quantifié. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

    Figure 5
    Figure 5: L'hypoxie diminue la prolifération des progéniteurs dans la niche de cellules souches rétiniennes de 4 dpf Embrayages de poissons zébrés. L'incorporation d'EdU a été mesurée après une impulsion d'EdU de 2 h dans des rétines colorées par DAPI à partir de 4 dpf d'embryons de poisson zèbre WTe maintenus etEr normoxia ( A ) ou dans la chambre hypoxique ( B ). Magenta: tache DAPI; Gris: tache EdU. Barres d'échelle = 50 μm ( C ) Quantification de l'expérience réalisée en B et C. Les barres d'erreur représentent les écarts-types. *** p -value <0,001; N = 7. Pour chaque état, 10 à 15 rétinas ont été quantifiées. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

    Figure 1 supplémentaire
    Figure 1 supplémentaire: les niveaux de HIF-1α augmentent lors de l'induction de l'hypoxie constamment dans différents puits de la plaque et entre différentes expériences. Des transferts Western de lysats de protéines à partir d'embryons Xenopus entiers sont conservés sous des concentrations normales d'oxygène ouDans deux puits différents de la chambre hypoxique sous induction d'hypoxie pendant 2 heures dans l'expérience 1 ( A ) ou dans l'expérience 2 ( B ). Des taches ont été sondées pour la sous-unité HIF-1α et l'α-tubuline. 5 embryons de grenouille de l'étape 38 ont été pris pour chaque état. Les expériences 1 et 2 sont des répliques biologiques indépendantes ( C, D ) Quantification des Western blots effectuées dans ( A, B ), respectivement. Les niveaux de protéines de HIF-1α ont été normalisés aux niveaux de protéines de l'α-tubuline. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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    Discussion

    Ici, nous avons présenté une nouvelle méthode simple mais robuste pour induire une hypoxie qui est ajustée pour être utilisée avec des embruns de grenouille et de poisson zèbre mais peut également être adaptée à d'autres organismes aquatiques. L'avantage majeur de cette méthode réside dans sa simplicité et sa rentabilité. Néanmoins, les résultats obtenus avec cette méthode sont très robustes. Nous avons montré que l'hypoxie peut être efficacement induite dans la chambre à la fois dans des embryons entiers ainsi que dans des tissus spécifiques - ici, les rétines. Pour déterminer l'efficacité de l'induction de l'hypoxie, nous avons surveillé les niveaux de protéine HIF-1α dans les lysats embryonnaires et rétiniens entiers. Selon nos résultats, l'induction de l'hypoxie peut être considérée comme réussie, si une augmentation des niveaux de HIF-1α peut être observée sur 1 h dans la chambre hypoxique par rapport au contrôle normoxique et normalisée aux niveaux globaux de protéines, par exemple , en utilisant des niveaux d'α-tubuline Comme contrôle. Nous avons confirmé l'activité de l'hypoxie dans les tissus en surveillant la prolifération des cellules souchesDans les rétines par l'incorporation d'EdU, et pourrait montrer, conformément à nos résultats publiés précédemment 13 , que l'hypoxie induite par l'installation présentée ici entraîne une diminution de la prolifération des cellules souches de la rétine dans les embryons de grenouille et de poisson zèbre.

    L'une des étapes essentielles de ce protocole est de s'assurer que la chambre hypoxique est correctement scellée. Il est réalisé en utilisant un joint d'étanchéité approprié sur le couvercle du réservoir, qui était une graisse de silicone dans notre cas. En outre, le placement dans un incubateur aidera à éviter les fuites d'oxygène atmosphérique dans la chambre, en fournissant une barrière supplémentaire. Une mesure de la concentration d'oxygène avec une sonde ou une électrode appropriée garantit également que les niveaux d'oxygène hypoxiques sont maintenus stables et sans fluctuations. En outre, il faut prendre soin d'éviter l'ouverture de la chambre pendant de longues périodes tout en échangeant des solutions ou des échantillons entre les expériences.

    Donné rapide equilLes temps d'ouverture de 10 à 15 min pour l'établissement de l'hypoxie, une seule quantité du mélange de gaz et un faible débit de gaz sont nécessaires pour maintenir le système même pendant des périodes plus longues que celles décrites dans les résultats représentatifs (24 h). Les solutions utilisées dans l'expérience devraient être pré-équilibrées pour obtenir une hypoxie pendant 15 min avant l'incubation dans la chambre (comme décrit dans 4.2.1). Nous avons utilisé la chambre hypoxique sur une période de 48 h d'hypoxie constante sans aucune erreur, comme le montrent nos mesures de concentration d'oxygène ( tableau 1 ). Il convient de noter que la diffusion correcte des gaz doit être contrôlée pendant des temps d'incubation plus longs. Enfin, il faut prendre soin de placer les embryons dans les puits (étape 2.2.1) pour éviter le mélange d'embryons à partir de différents animaux mutants / conditions expérimentales. Ceci est assez simple à réaliser compte tenu des parois relativement élevées des puits individuels de la plaque.

    En dépit d'être simple mais efficaceEt un système robuste pour l'induction de l'hypoxie, l'utilisation de la chambre décrite ici présente un inconvénient pour les expériences nécessitant l'utilisation de solutions et de moyens d'incubation coûteux. Le volume minimal de média dans le réservoir de la chambre ne doit pas dépasser 400 mL. Cependant, des ajustements peuvent être adaptés aux volumes inférieurs: nous avons réussi à ajuster la longueur des tiges ( Figure 1E ) attachées à la plaque (2.1.4 et 4.2.1) afin que nous n'exigions que 50 mL de support / solution . Bien qu'il ne soit pas idéal pour des temps d'incubation plus long, cette configuration peut être adaptée au même tube de gaz et peut être correctement scellée pour assurer une hypoxie suffisante jusqu'à 8 h.

    Ensemble, notre configuration de la chambre à gaz peut être utilisée pour être utilisée avec n'importe quel organisme modèle aquatique et se distingue des autres systèmes commerciaux similaires par sa simplicité, sa rentabilité et sa robustesse. Une fois maîtrisé, il peut être utilisé pour des expériences directes in vivo , une période de temps donnée et sous n'importe quel désirD atmosphère gazeuse, y compris l'hypoxie, l'hyperoxie ou d'autres mélanges de gaz.

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    Disclosures

    Les auteurs déclarent qu'ils n'ont pas d'intérêts financiers concurrents.

    Acknowledgments

    Ce travail a été soutenu par le soutien de Wellcome Trust SIA Award 100329 / Z / 12 / Z à WAH et la bourse DFG KH 376 / 1-1 décerné à HK

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Sodium chloride Sigma S7653 NaCl/0.1x MBS, Embryo medium, 10x TBST
    Potassium chloride Sigma P9333 KCl/0.1x MBS, Embryo mediu,
    Sodium bicarbonate Sigma S5761 NaHCO3/0.1x MBS
    HEPES Sigma H3375 0.1x MBS
    Magnesium sulfate Sigma M7506 MgSO4/0.1x MBS, Embryo medium
    Calcium nitrate Sigma 202967 Ca(NO3)2/0.1x MBS
    Calcium chloride Sigma C1016 CaCl2/0.1x MBS, Embryo medium
    Methylene blue Sigma M9140 Embryo medium
    Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) Sigma CG10 Frog fertilization
    Zebrafish breeding tank Carolina 161937 Gas chamber construction
    24-well plate Thermo Scientific 142475 Nunclon Delta Surface, for gas chamber construction
    Epoxy resin RS Components UK Kit 199-1468
    Gas distributor valve WPI Luer Valves Kit 14011 Aquatic tank attachment (Schema 1, H)
    High precision gas valve BOC  200 bar HiQ C106X/2B Gas tank attachment (Schema 1, I)
    5% oxygen and 95% N2 gas tank BOC 226686-L Hypoxic gas mixture
    ceramic disc diffuser CO2 Art  Glass CO2 Nano Aquarium Diffuser, DG005DG005 Schema 1, J
    silicone grease Scientific Laboratory Supplies VAC1100 Schema 1, K
    oxymeter Oxford Optronix  Oxylite, CP/022/001 Hypoxic chamber setup
    fibre-optic dissolved oxygen sensor Oxford Optronix HL_BF/OT/E Hypoxic chamber setup
    plastic pasteur pipette Sterilin STS3855604D For embryo transfer
    MS222  Sigma Aldrich E10521-50G Embryo anesthetic
    RIPA buffer  Sigma R0278-50ML Tissue homogenization
    Protease inhibitor Sigma P8340 Tissue homogenization
    Tris Sigma 77-86-1 4x Laemmli loading buffer, 10x TBST
    Glycerol Sigma G5516 4x Laemmli loading buffer
    Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Sigma L3771 4x Laemmli loading buffer, 5x Running buffer
    beta-Mercaptoethanol  Sigma M6250 4x Laemmli loading buffer
    Bromophenol Blue Sigma-Aldrich B0126 4x Laemmli loading buffer
    Trizma base  Sigma 77-86-1 5x Running buffer, Transfer buffer
    Glycine Sigma G8898 5x Running buffer, Transfer buffer
    Methanol Sigma 34860 Transfer buffer
    Tween 20 Sigma P2287-500ML 10x TBST
    skim milk powder Sigma 70166 Blocking Solution
    Eppendorf microcentrifuge tube Sigma T9661
    tissue homogenizer Pellet Pestle Motor Kontes Z359971 Tissue homogenization
    pellet pestles Sigma Z359947-100EA Tissue homogenization
    precast 12% gel Biorad Mini-ProteinTGX, 456-1043 Western Blot
    protein ladder Amersham Full-Range Rainbow ladder, RPN800E Western Blot
    nitrocellulose membrane (0.45 µm) Biorad 162-0115 Western Blot
    anti-HIF-1α antibody Abcam ab2185 Western Blot
    anti-α-tubulin antibody Sigma T6074 Western Blot
    goat anti-rabbit antibody Abcam ab6789 Western Blot
    goat anti-mouse antibody Abcam ab97080 Western Blot
    Pierce ECL 2 reagent  Thermo Scientific 80196 Western Blot
    ECL films Hyperfilm GE Healthcare Amersham 28906837 Western Blot
    5-Ethynyl-2′-deoxyuridine   santa cruz CAS 61135-33-9 EdU, EdU incorporation
    Phosphate-buffered Saline (PBS) Oxoid BR0014G 1x
    Formaldehyde Thermo Scientific 28908 Fixation solution
    Sucrose Fluka S/8600/60 Solution solution
    Triton X-100 Sigma T9284-500ML PBST
    Heat-inactivated Goat Serum (HiGS) Sigma G6767-100ml Blocking solution (EdU incorporation)
    4',6-diamidino-2-phenylindole  ThermoFisher Scientific D1306 DAPI, EdU incorporation
    Dimethyl sulfoxide (DMSO) Molecular Probes C10338 EdU incorporation
    glass vial VWR 98178853 EdU incorporation analysis
    Tissue-Plus optimal cutting temperature compound  Scigen 4563 Embedding medium, EdU incorporation analysis
    cryostat Jung Fridgocut 2800E Leica  CM3035S EdU incorporation analysis
    microscope slides Super-Frost plus Menzel glass Thermo Scientific J1800AMNZ EdU incorporation analysis
    EdU Click-iT chemistry kit Molecular Probes C10338 EdU incorporation analysis
    FluorSave Calbiochem D00170200 Mounting medium, EdU incorporation analysis
    coverslips VWR ECN631-1575 EdU incorporation analysis
    fluorescent microscope Nikon Eclipse 80i EdU incorporation analysis
    confocal scanning microscope Olympus Fluoview FV1000 EdU incorporation analysis
    Volocity software PerkinElmer Volocity 6.3 EdU incorporation analysis

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    References

    1. Grocott, M., Montgomery, H., Vercueil, A. High-altitude physiology and pathophysiology: implications and relevance for intensive care medicine. Crit Care. 11 (1), 203 (2007).
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    Tags

    Biologie du développement numéro 124 embryons de grenouilles embryons de poissons zèbres hypoxie chambre hypoxique développement embryonnaire cellules souches rétiniennes
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    Khaliullina-Skultety, H., Zi Chao, N., Harris, W. A. Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (124), e55710, doi:10.3791/55710 (2017).

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