Site d'intégration bidirectionnel Retroviral Méthodologie PCR et analyse de données quantitatives Workflow
Summary
Ce manuscrit décrit la procédure expérimentale et l'analyse de logiciel pour un test de site d'intégration bidirectionnelle qui peut analyser simultanément l'ADN de jonction vecteur-hôte en amont et en aval. Les produits de PCR bidirectionnels peuvent être utilisés pour toute plate-forme de séquençage en aval. Les données résultantes sont utiles pour une comparaison quantitative à haut débit des cibles intégrées d'ADN.
Abstract
Les analyses du site d'intégration (IS) sont une composante essentielle de l'étude des sites d'intégration rétroviraux et leur importance biologique. Dans les récentes études de thérapie génique rétrovirale, les tests IS, en combinaison avec le séquençage de la prochaine génération, ont été utilisés comme outil de suivi des cellules pour caractériser les cellules clonales de cellules souches partageant le même IS. Pour la comparaison précise de la réapprovisionnement de clones de cellules souches à l'intérieur et à travers différents échantillons, la sensibilité de détection, la reproductibilité des données et la capacité à haut débit de l'analyse sont parmi les qualités d'analyse les plus importantes. Ce travail fournit un protocole détaillé et un workflow d'analyse de données pour l'analyse IS bidirectionnelle. Le dosage bidirectionnel peut simultanément séquencer les jonctions vecteur-hôte en amont et en aval. Par rapport aux approches de séquençage IS unidirectionnelles conventionnelles, l'approche bidirectionnelle améliore considérablement les taux de détection IS et la caractérisation des événements d'intégration aux deux extrémités de tIl cible l'ADN. Le pipeline d'analyse de données décrit ici identifie et énumère avec précision des séquences IS identiques à travers plusieurs étapes de comparaison qui mettent en place des séquences IS dans le génome de référence et déterminent les erreurs de séquençage. En utilisant une procédure de dosage optimisée, nous avons récemment publié les modèles de repeuplement détaillés de milliers de clones de cellules souches hématopoïétiques (HSC) après transplantation dans des macaques rhésus, démontrant pour la première fois le point précis du repopulation HSC et l'hétérogénéité fonctionnelle des HSC dans le Système de primates. Le protocole suivant décrit la procédure expérimentale étape par étape et le flux de travail d'analyse de données qui identifie et quantifie précisément les séquences IS identiques.
Introduction
Les rétrovirus insèrent leur ADN génomique dans le génome hôte dans différents sites. Cette propriété unique, qui peut contribuer au développement de cancers et d'autres formes de pathogenèse virale, a l'avantage ironique de rendre ces virus hautement accessibles à l'ingénierie cellulaire pour la thérapie génique et la recherche biologique de base. Le site d'intégration virale (IS) – l'emplacement sur le génome hôte où un ADN étranger (virus) est intégré – a des implications importantes pour le sort des virus intégrés et des cellules hôtes. Les tests IS ont été utilisés dans divers contextes de recherche biologique et clinique pour étudier la sélection et la pathogenèse du site d'intégration rétrovirale, le développement du cancer, la biologie des cellules souches et la biologie du développement 1 , 2 , 3 , 4 . Une faible sensibilité à la détection, une faible reproductibilité des données et une contamination croisée fréquente sont parmiLes facteurs clés limitant les applications des tests IS aux études actuelles et planifiées.
De nombreuses technologies d'analyse IS ont été développées. Les essais sur le site d'intégration à base d'enzyme à restriction, y compris la réaction en chaîne par polymérase (PCR) 5 , la PCR inverse 6 et la PCR 7 à médiation par amplification linéaire (LAM), sont les plus utilisés. L'utilisation d'enzymes de restriction spécifiques au site, cependant, génère un biais lors de la récupération de l'IS, permettant seulement un sous-ensemble d'intégres (un ADN étranger intégré dans le génome de l'hôte) au voisinage du site de restriction à récupérer 4 . Des technologies d'analyse qui permettent d'évaluer plus largement le vecteur IS ont également été introduites ces dernières années. Ces essais utilisent diverses stratégies, y compris la PCR 8 à médiation par transposon de Mu, non restrictive (nr) -LAM PCR 9 , enzyme de restriction de type II-mLa digestion éditée 10 , le cisaillement mécanique 11 et la PCR à l'hexamère aléatoire (Re-free PCR) 12 , pour fragmenter les ADN génomiques et amplifier l'IS. Les technologies actuelles ont différents niveaux de sensibilité à la détection, la couverture du génome, la spécificité cible, la capacité à haut débit, la complexité des procédures d'analyse et les biais dans la détection des fréquences relatives des sites cibles. Étant donné les différentes qualités des analyses existantes et la variété des buts pour lesquels elles peuvent être utilisées, l'approche d'analyse optimale doit être soigneusement sélectionnée.
Ce travail fournit des procédures expérimentales détaillées et un flux de travail d'analyse de données de calcul pour un test bidirectionnel qui améliore de manière significative les taux de détection et la précision de la quantification des séquences en analysant simultanément l'IS en amont et en aval de l'ADN cible intégré (voir la figure 1 pour une vue schématique des procédures de dosage ). Cette approche fournit égalementS le moyen de caractériser le processus d'intégration rétrovirale (par exemple, la fidélité à la duplication du site cible et les variations dans les séquences génomiques des insertions en amont et en aval). D'autres méthodes bidirectionnelles ont été utilisées principalement pour le clonage et le séquençage des deux extrémités de l'ADN cible 11 , 13 , 14 . Ce test est largement optimisé pour la quantification à haut débit et reproductible des clones vectorisés, en utilisant la méthode LM-PCR et la cartographie de l'analyse calculée, ainsi que pour la quantification des jonctions amont et aval. L'analyse bidirectionnelle avec l'enzyme TaqαI s'est révélée utile pour la quantification clonale à haut débit dans les études précliniques de thérapie génique de cellules souches 2 , 15 . Cet article décrit une méthode modifiée utilisant un coupeur plus fréquent (RsaI / CviQI – motif: GTAC) qui doubleIl existe des chances de détecter des globules par rapport à un dosage basé sur TaqαI . Des procédures détaillées d'analyse expérimentale et de données qui utilisent des enzymes de motifs GTAC pour les lentiviraux (NL4.3 et ses dérivés) et les analyses gamma-rétrovirales (vecteurs pMX) IS sont décrites. Les oligonucleotides utilisés dans le dosage sont listés dans le tableau 1 . Un script de programmation interne pour l'analyse de séquence IS est fourni dans le document complémentaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'essai bidirectionnel permet d'analyser simultanément les séquences de jonction d'ADN vecteur-hôte amont (gauche) et aval (droite) et est utile dans plusieurs applications de thérapie génique, de cellules souches et de recherche sur le cancer. L'utilisation d'enzymes de motif GTAC (RsaI et CviQI) et l'approche PCR bidirectionnelle améliore considérablement les chances de détection d'un integrome (ou d'une population clonale) par rapport aux dosages à base d'enzymes motifs TC…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le financement a été fourni par les Instituts nationaux de subventions de santé R00-HL116234, U19 AI117941 et R56 HL126544; La Fondation nationale pour la science Grant DMS-1516675; La National Research Foundation of Korea (NRF-2011-0030049, NRF-2014M3C9A3064552); Et le programme d'initiative KRIBB.
Materials
| Thermostable DNA polymerase | Agilent | 600424 | PicoMaxx Polymerase |
| Thermostable DNA polymerase buffer | Agilent | 600424 | PicoMaxx Polymerase buffer |
| Deoxynucleotide (dNTP) solution mix | New England Biolabs | N0447L | dNTP solution mix (10mM each) |
| PCR tubes | VWR International | 53509-304 | PCR Strip Tubes With Individual Attached Caps |
| 2ml microcentrifuge tube | Molecular Bioproducts | 3453 | microcentrifuge tubes |
| PCR purification kit | Qiagen | 28106 | |
| RsaI | New England Biolabs | R0167L | restriction enzyme |
| CviQI | New England Biolabs | R0639L | restriction enzyme |
| Buffer A | New England Biolabs | B7204S | NEB CutSmart buffer |
| DNA Polymerase I large (klenow) fragment | New England Biolabs | M0210L | Blunting |
| streptavidin beads solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
| Binding Solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
| Washing Solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
| magnetic stand | ThermoFisher | 12321D | DynaMag™-2 Magnet |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202L | T4 DNA ligase |
| 10X T4 DNA ligase buffer | New England Biolabs | B0202S | T4 DNA ligase reaction buffer |
| 5X T4 DNA ligase buffer | Invitrogen | 46300-018 | T4 DNA ligase buffer with polyethylene glycol-8000 |
| UV-Vis spectrophotometer | Fisher Scientific | S06497 | Nanodrop 2000 |
| pvuII | new England Biolabs | R0151L | restriction enzyme |
| sfoI | new England Biolabs | R0606L | restriction enzyme |
| Buffer B | new England Biolabs | B7203S | NEB buffer 3.1 |
| Nuclease free water | Integrated DNA Technologies | 11-05-01-14 | |
| Capillary electrophoresis | Qiagen | 9001941 | QIAxcel capillary electrophoresis |
| Veriti 96-well Fast Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | 4375305 | PCR Instrument |
| Rotating wheel (or Roller) | Eppendorf | M10534004 | Cell Culture Roller Drums |
| DNA size marker | Qiagen | 929559 | QX size marker (100-2,500 bp) |
| DNA size marker | Qiagen | 929554 | QX size marker (50-1,500 bp) |
| DNA alignment markers | Qiagen | 929524 | QX DNA Alignment Marker |
| genomc DNA | Not Available | Not Available | Sample genomc DNA from in vivo or in vitro experiments |
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