双方向レトロウイルスの統合サイトPCRの方法論と定量的データ解析ワークフロー
Summary
この原稿では、上流および下流のベクター – 宿主接合DNAを同時に解析できる双方向インテグレーションサイトアッセイの実験手順とソフトウェア解析について説明します。双方向PCR産物は、任意の下流の配列決定プラットフォームに使用することができる。得られたデータは、統合されたDNA標的の高スループット、定量的比較に有用である。
Abstract
統合サイト（IS）アッセイは、レトロウイルスの組込み部位およびその生物学的意義の研究の重要な要素である。最近のレトロウイルス遺伝子治療研究において、ISアッセイは、次世代シークエンシングと組み合わせて、同じISを共有するクローン幹細胞集団を特徴付ける細胞追跡ツールとして用いられてきた。異なるサンプル内およびその間の再増殖幹細胞クローンの正確な比較のために、アッセイの検出感度、データ再現性およびハイスループット能力は、最も重要なアッセイ特性の1つである。この作業は、双方向IS解析のための詳細なプロトコルとデータ解析のワークフローを提供します。双方向アッセイは、上流および下流の両方のベクター – 宿主接合部を同時に配列決定することができる。従来の単方向ISシークエンス手法と比較して、双方向アプローチはIS検出速度を大幅に改善し、tの両端での統合事象の特徴付けを大幅に改善する彼はDNAを標的にする。ここに記載されているデータ解析パイプラインは、IS配列を参照ゲノム上にマッピングし、シークエンシングエラーを決定する複数の比較ステップを経て、同一のIS配列を正確に同定および列挙する。最適化されたアッセイ手順を使用して、近年、アカゲザルでの移植後に何千もの造血幹細胞（HSC）クローンの詳細な再増殖パターンを発表し、HSC再増殖の正確な時点およびHSCの機能的異種性を初めて示した。霊長類システム。以下のプロトコルは、同一のIS配列を正確に同定および定量する、段階的な実験手順およびデータ解析ワークフローを説明しています。
Introduction
レトロウイルスは、そのゲノムDNAを様々な部位の宿主ゲノムに挿入する。癌やその他のウイルス性病因の発生に寄与するこのユニークな特性は、これらのウイルスを遺伝子治療や基礎生物学研究のための細胞工学に非常に適したものにするという皮肉な利点があります。外来DNA（ウイルス）が組み込まれている宿主ゲノム上の場所であるウイルス統合サイト（IS）は、統合ウイルスと宿主細胞の両方の運命に重要な意味を持っています。 ISアッセイは、レトロウイルスの組込み部位の選択と病因、癌の発生、幹細胞の生物学、および発達生物学1,2,3,4を研究するために、様々な生物学的および臨床的研究環境で使用されてきた。低い検出感度、低いデータ再現性、頻繁な相互汚染は現在のおよび計画された研究へのISアッセイの適用を制限する重要な要因である。
多くのIS分析技術が開発されている。リンカー媒介（LM）ポリメラーゼ連鎖反応（PCR） 5 、逆PCR6、および線状増幅媒介（LAM）PCR7を含む制限酵素に基づく組込み部位アッセイが最も広く使用されている。しかしながら、部位特異的制限酵素の使用は、ISの回収中にバイアスを生成し、回収される制限部位の近傍の組込み体（宿主ゲノムに組み込まれた外来DNA）のサブセットのみを可能にする4 。近年、ベクターISをより包括的に評価するアッセイ技術も導入されている。これらのアッセイは、Muトランスポゾン媒介PCR8、非限定的（nr）-LAM PCR9、タイプII制限酵素-m（re-free PCR） 12を用いて 、ゲノムDNAを断片化し、ISを増幅させるために、遺伝子操作された消化10 、機械的せん断11 、およびランダムヘキサマーベースのPCR現在の技術は、検出感度、ゲノムカバレッジ、標的特異性、ハイスループット容量、アッセイ手順の複雑さ、および標的部位の相対頻度の検出における偏りのレベルが様々である。既存のアッセイの様々な性質およびそれらが使用され得る様々な目的が与えられた場合、最適なアッセイ手法を注意深く選択する必要があります。
この作業では、統合された標的DNAの上流および下流を同時に解析することにより、検出率および配列定量精度を大幅に向上させる双方向アッセイの詳細な実験手順および計算データ解析ワークフローを提供します（図1を参照） ）。このアプローチはまた、レトロウイルス組み込みプロセス（例えば、標的部位重複の忠実度および上流および下流挿入のゲノム配列の変動）を特徴付ける手段である。他の双方向法は、標的DNA11,13,14の両端をクローニングおよび配列決定するために主に使用されている。このアッセイは、十分に確立されたLM-PCR法および計算解析マッピングを使用し、上流および下流接合部の両方を定量するために、ベクター標識クローンのハイスループットおよび再現性のある定量化のために広く最適化されている。 TaqαI酵素による双方向分析は、幹細胞遺伝子治療前臨床試験における高スループットクローン定量化に有用であることが証明されている2,15 。本稿では、より頻繁に使用されるカッター（RsaI / CviQI – モチーフ：GTAC）を用いて、tTaqαIに基づくアッセイと比較してインテグロムを検出する可能性がある。レンチウイルス（NL4.3およびその誘導体）およびガンマ – レトロウイルス（pMXベクター）ベクターIS分析にGTACモチーフ酵素を用いる詳細な実験およびデータ解析手順が記載されている。アッセイに用いたオリゴヌクレオチドを表1に列挙する。補遺資料には、IS配列解析のための社内プログラミングスクリプトが用意されています。
Protocol
Representative Results
Discussion
双方向アッセイは、上流（左）および下流（右）の両方のベクター – 宿主DNA接合配列の同時分析を可能にし、遺伝子治療、幹細胞および癌研究の多くの用途において有用である。 GTACモチーフ酵素（RsaIおよびCviQI）および双方向PCR法を用いることにより、以前のTCGAモチーフ酵素（ TaqαI ）に基づくアッセイ2,15および他のものと比較して、インテグラム（またはクロー?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
資金提供は、国立衛生研究所R00-HL116234、U19 AI117941、およびR56 HL126544によって提供された。国立科学財団グラントDMS-1516675;韓国国立研究財団（NRF-2011-0030049、NRF-2014M3C9A3064552）; KRIBBイニシアチブ・プログラムを発表しました。
Materials
| Thermostable DNA polymerase | Agilent | 600424 | PicoMaxx Polymerase |
| Thermostable DNA polymerase buffer | Agilent | 600424 | PicoMaxx Polymerase buffer |
| Deoxynucleotide (dNTP) solution mix | New England Biolabs | N0447L | dNTP solution mix (10mM each) |
| PCR tubes | VWR International | 53509-304 | PCR Strip Tubes With Individual Attached Caps |
| 2ml microcentrifuge tube | Molecular Bioproducts | 3453 | microcentrifuge tubes |
| PCR purification kit | Qiagen | 28106 | |
| RsaI | New England Biolabs | R0167L | restriction enzyme |
| CviQI | New England Biolabs | R0639L | restriction enzyme |
| Buffer A | New England Biolabs | B7204S | NEB CutSmart buffer |
| DNA Polymerase I large (klenow) fragment | New England Biolabs | M0210L | Blunting |
| streptavidin beads solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
| Binding Solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
| Washing Solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
| magnetic stand | ThermoFisher | 12321D | DynaMag™-2 Magnet |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202L | T4 DNA ligase |
| 10X T4 DNA ligase buffer | New England Biolabs | B0202S | T4 DNA ligase reaction buffer |
| 5X T4 DNA ligase buffer | Invitrogen | 46300-018 | T4 DNA ligase buffer with polyethylene glycol-8000 |
| UV-Vis spectrophotometer | Fisher Scientific | S06497 | Nanodrop 2000 |
| pvuII | new England Biolabs | R0151L | restriction enzyme |
| sfoI | new England Biolabs | R0606L | restriction enzyme |
| Buffer B | new England Biolabs | B7203S | NEB buffer 3.1 |
| Nuclease free water | Integrated DNA Technologies | 11-05-01-14 | |
| Capillary electrophoresis | Qiagen | 9001941 | QIAxcel capillary electrophoresis |
| Veriti 96-well Fast Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | 4375305 | PCR Instrument |
| Rotating wheel (or Roller) | Eppendorf | M10534004 | Cell Culture Roller Drums |
| DNA size marker | Qiagen | 929559 | QX size marker (100-2,500 bp) |
| DNA size marker | Qiagen | 929554 | QX size marker (50-1,500 bp) |
| DNA alignment markers | Qiagen | 929524 | QX DNA Alignment Marker |
| genomc DNA | Not Available | Not Available | Sample genomc DNA from in vivo or in vitro experiments |
References
- Serrao, E., Engelman, A. N. Sites of Retroviral DNA Integration: From Basic Research to Clinical Applications. Crit. Rev. Biochem. Mol. Bio. 51 (1), 26-42 (2016).
- Kim, S., et al. Dynamics of HSPC Repopulation in Nonhuman Primates Revealed by a Decade-Long Clonal-Tracking Study. Cell Stem Cell. 14 (4), 473-485 (2014).
- Bushman, F. Retroviral integration and human gene therapy. J. Clin. Invest. 117 (8), 2083-2086 (2007).
- Bystrykh, L. V., Verovskaya, E., Zwart, E., Broekhuis, M., de Haan, G. Counting stem cells: methodological constraints. Nat Meth. 9 (6), 567-574 (2012).
- Schröder, A., et al. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell. 110 (4), 521-529 (2002).
- Silver, J., Keerikatte, V. Novel use of polymerase chain reaction to amplify cellular DNA adjacent to an integrated provirus. J. Virol. 64, 3150 (1990).
- Schmidt, M., et al. High-resolution insertion-site analysis by linear amplification-mediated PCR (LAM-PCR). Nat. Meth. 4 (12), 1051-1057 (2007).
- Brady, T., et al. A method to sequence and quantify DNA integration for monitoring outcome in gene therapy. Nucleic Acids Res. 39 (11), e72 (2011).
- Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat. Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).
- Kim, S., Kim, Y., Liang, T., Sinsheimer, J., Chow, S. A high-throughput method for cloning and sequencing human immunodeficiency virus type 1 integration sites. J. Virol. 80 (22), 11313-11321 (2006).
- Maldarelli, F., et al. Specific HIV integration sites are linked to clonal expansion and persistence of infected cells. Science. 345 (6193), 179-183 (2014).
- Wu, C., et al. High Efficiency Restriction Enzyme-Free Linear Amplification-Mediated Polymerase Chain Reaction Approach for Tracking Lentiviral Integration Sites Does Not Abrogate Retrieval Bias. Hum. Gene. Ther. 24 (1), 38-47 (2013).
- Aker, M., Tubb, J., Miller, D. G., Stamatoyannopoulos, G., Emery, D. W. Integration Bias of Gammaretrovirus Vectors following Transduction and Growth of Primary Mouse Hematopoietic Progenitor Cells with and without Selection. Mol. Ther. 14 (2), 226-235 (2006).
- Gabriel, R., Kutschera, I., Bartholomae, C. C., von Kalle, C., Schmidt, M. Linear Amplification Mediated PCR; Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA. J Vis Exp. (88), e51543 (2014).
- Kim, S., et al. High-throughput, sensitive quantification of repopulating hematopoietic stem cell clones. J. Virol. 84 (22), 11771-11780 (2010).
- Mitchell, R., et al. Retroviral DNA integration: ASLV, HIV, and MLV show distinct target site preferences. PLoS Biol. 2 (8), e234 (2004).
- Melkus, M., et al. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nat. Med. 12 (11), 1316-1322 (2006).
- Bystrykh, L. V. A combinatorial approach to the restriction of a mouse genome. BMC Res Notes. 6, 284 (2013).
- Beard, B. C., Adair, J. E., Trobridge, G. D., Kiem, H. -. P. High-throughput genomic mapping of vector integration sites in gene therapy studies. Methods Mol Biol. , 321-344 (2014).
- Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat. Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).
- Qin, X., An, D., Chen, I., Baltimore, D. Inhibiting HIV-1 infection in human T cells by lentiviral-mediated delivery of small interfering RNA against CCR5. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (1), 183-188 (2003).
- Kitamura, T., et al. Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics. Exp. Hematol. 31 (11), 1007-1014 (2003).
- Cartier, N., et al. Hematopoietic stem cell gene therapy with a lentiviral vector in X-linked adrenoleukodystrophy. Science. 326 (5954), 818-823 (2009).
