Método de Implementação de Retroviral Bidirecional e Metodologia de PCR e Análise Quantitativa de Dados Workflow

Summary

Este manuscrito descreve o procedimento experimental e análise de software para um ensaio de site de integração bidirecional que pode simultaneamente analisar DNA de junção vetor-hospedeiro a montante e a jusante. Os produtos de PCR bidirecionais podem ser usados ​​para qualquer plataforma de seqüência a jusante. Os dados resultantes são úteis para uma comparação quantitativa de alto rendimento de alvos de DNA integrados.

Abstract

Os ensaios do Site de Integração (IS) são um componente crítico do estudo dos sites de integração retroviral e sua importância biológica. Nos recentes estudos de terapia de genes retrovirais, os ensaios de IS, em combinação com a sequenciação da próxima geração, foram utilizados como ferramenta de rastreamento celular para caracterizar as populações de células-tronco clonais que compartilham o mesmo IS. Para a comparação precisa de repetir os clones de células-tronco dentro e entre diferentes amostras, a sensibilidade de detecção, a reprodutibilidade dos dados e a capacidade de alto rendimento do ensaio estão entre as qualidades de ensaio mais importantes. Este trabalho fornece um fluxo de trabalho detalhado de análise de dados e dados para a análise IS bidirecional. O ensaio bidirecional pode simultaneamente seqüenciar junções vetor-host a montante e a jusante. Comparado com as abordagens convencionais de seqüenciamento IS unidirecional, a abordagem bidirecional melhora significativamente as taxas de detecção de IS e a caracterização de eventos de integração em ambas as extremidades de tEle alvo DNA. O encanamento de análise de dados descrito aqui identifica e enumera com precisão as seqüências IS idênticas através de várias etapas de comparação que mapeiam as seqüências IS no genoma de referência e determinam erros de seqüenciamento. Usando um procedimento de ensaio otimizado, publicamos recentemente os padrões de repovoamento detalhados de milhares de clones de células estaminais hematopoiéticas (HSC) após transplante em macacos rhesus, demonstrando pela primeira vez o ponto de tempo preciso do repovoamento de HSC e a heterogeneidade funcional de HSCs no Sistema de primatas. O protocolo a seguir descreve o procedimento experimental passo a passo e fluxo de trabalho de análise de dados que identifica e quantifica precisamente as seqüências IS idênticas.

Introduction

Retroviruses inserem seu DNA genômico no genoma do hospedeiro em vários locais. Esta propriedade única, que pode contribuir para o desenvolvimento de cânceres e outras formas de patogênese viral, tem o benefício irônico de tornar esses vírus altamente acessíveis à engenharia celular para terapia genética e pesquisa de biologia básica. O site de integração viral (IS) – a localização no genoma do hospedeiro onde um DNA estrangeiro (vírus) está integrado – tem implicações importantes para o destino dos vírus integrados e das células hospedeiras. Os ensaios IS foram utilizados em várias configurações de pesquisa biológica e clínica para estudar a seleção do site de integração retroviral e patogênese, desenvolvimento do câncer, biologia das células-tronco e biologia do desenvolvimento ^{1 , 2 , 3 , 4} . Baixa sensibilidade de detecção, baixa reprodutibilidade de dados e freqüente contaminação cruzada estão entreOs principais fatores que limitam as aplicações dos ensaios IS aos estudos atuais e planejados.

Muitas tecnologias de análise IS foram desenvolvidas. Os ensaios de locais de integração baseados em enzimas de restrição, incluindo a Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) ⁵ , a PCR inversa ⁶ e o PCR ⁷ da Medição Lineada por Amplificação (LAM), são os mais amplamente utilizados. O uso de enzimas de restrição específicas do site, no entanto, gera um viés durante a recuperação do IS, permitindo apenas um subconjunto de integromes (um DNA estrangeiro integrado no genoma do hospedeiro) na proximidade do site de restrição a ser recuperado ⁴ . As tecnologias de ensaio que avaliam mais detalhadamente o vetor IS também foram introduzidas nos últimos anos. Esses ensaios empregam várias estratégias, incluindo o PCR ⁸ mediado por Transposon, não restritivo (nr) -LAM PCR ⁹ , enzima de restrição do tipo II-mDigestão editada ¹⁰ , cisalhamento mecânico ¹¹ e PCR aleatória baseada em hexâmero (Re-free PCR) ¹² , para fragmentar DNAs genômicos e amplificar IS. As tecnologias atuais têm níveis variáveis ​​de sensibilidade de detecção, cobertura de genoma, especificidade de alvo, capacidade de alto rendimento, complexidade de procedimentos de teste e vies na detecção de frequências relativas de sites alvo. Dadas as diferentes qualidades dos ensaios existentes e a variedade de propósitos para os quais eles podem ser usados, a abordagem de ensaio ideal deve ser cuidadosamente selecionada.

Este trabalho fornece procedimentos experimentais detalhados e um fluxo de trabalho de análise de dados computacionais para um ensaio bidirecional que melhora significativamente as taxas de detecção e a precisão da quantificação da seqüência ao analisar simultaneamente o IS a montante e a jusante do DNA alvo integrado (ver Figura 1 para uma visão esquemática dos procedimentos de ensaio ). Esta abordagem também forneceS os meios para caracterizar o processo de integração retroviral (por exemplo, a fidelidade da duplicação do site alvo e as variações nas seqüências genômicas das inserções a montante e a jusante). Outros métodos bidirecionais foram utilizados principalmente para clonagem e seqüenciamento de ambas as extremidades do DNA alvo ^{11 , 13 , 14} . Este ensaio é amplamente otimizado para a quantificação de alto rendimento e reproduzível de clones marcados por vetores, utilizando o método de LM-PCR bem estabelecido e o mapeamento de análise computacional e para quantificar as junções a montante e a jusante. A análise bidirecional com a enzima TaqαI provou ser útil para quantificação clonal de alto rendimento em estudos pré-clínicos de terapia de células-tronco ^{2 , 15} . Este artigo descreve um método modificado usando um cortador mais freqüente (RsaI / CviQI – motivo: GTAC) que dobra tAs chances de detectar integromes em comparação com um teste baseado em TaqαI . Procedimentos detalhados de análise experimental e de dados que utilizam as enzimas do motivo GTAC para o lentiviral (NL4.3 e suas derivadas) e as análises do vector IS da gama-retroviral (vetores pMX) são descritas. Os oligonucleótidos utilizados no ensaio estão listados na Tabela 1 . Um script de programação interno para análise de seqüência IS é fornecido no documento suplementar.

Protocol

1. Gerando Bibliotecas de Seqüência de Junção (esquerda) e a jusante (direita) Preparação do linkador de DNA: Prepare uma solução de ADN de ligação de 10 μL adicionando 2 μL de oligos de LINQUER_A 100 μM (final: 20 μM), 2 μL de oligos de LINQUER_B 100 μM (final: 20 μM), 2 μL de NaCl 5 M (final: 1M) e 4 μL de água livre de nuclease num tubo de PCR. Consulte a Tabela 1 para as sequências do linker. Incube a solução de DNA do linker a 95…

Representative Results

O ensaio IS bidirecional gerou diferentes tamanhos de amplicões de PCR para as junções de hospedeiros vetoriais a montante (esquerda) e a jusante (direita) ( Figura 2 ). O tamanho de um amplicon de PCR depende da localização do motivo GTAC mais próximo a montante e a jusante de um integrome. O ensaio também produziu amplicões internos de PCR de DNA: seqüências retrovirais perto do trato de polipurina e o local de ligação do iniciador foram amplif…

Discussion

O ensaio bidirecional permite a análise simultânea de ambas as sequências de junção de DNA do vetor do vetor a montante (esquerda) e a jusante (direita) e é útil em uma série de aplicações de terapia genética, células-tronco e pesquisa de câncer. O uso de enzimas com motivo GTAC (RsaI e CviQI) e a abordagem de PCR bidirecional melhora significativamente as chances de detectar um integrome (ou uma população clonal) quando comparado aos ensaios baseados em enzimas de TCGA-padrão ( TaqαI ) <sup cl…

Materials

Thermostable DNA polymerase	Agilent	600424	PicoMaxx Polymerase
Thermostable DNA polymerase buffer	Agilent	600424	PicoMaxx Polymerase buffer
Deoxynucleotide (dNTP) solution mix	New England Biolabs	N0447L	dNTP solution mix (10mM each)
PCR tubes	VWR International	53509-304	PCR Strip Tubes With Individual Attached Caps
2ml microcentrifuge tube	Molecular Bioproducts	3453	microcentrifuge tubes
PCR purification kit	Qiagen	28106
RsaI	New England Biolabs	R0167L	restriction enzyme
CviQI	New England Biolabs	R0639L	restriction enzyme
Buffer A	New England Biolabs	B7204S	NEB CutSmart buffer
DNA Polymerase I large (klenow) fragment	New England Biolabs	M0210L	Blunting
streptavidin beads solution	Invitrogen	60101	Dynabeads kilobaseBINDER kit
Binding Solution	Invitrogen	60101	Dynabeads kilobaseBINDER kit
Washing Solution	Invitrogen	60101	Dynabeads kilobaseBINDER kit
magnetic stand	ThermoFisher	12321D	DynaMag™-2 Magnet
T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202L	T4 DNA ligase
10X T4 DNA ligase buffer	New England Biolabs	B0202S	T4 DNA ligase reaction buffer
5X T4 DNA ligase buffer	Invitrogen	46300-018	T4 DNA ligase buffer with polyethylene glycol-8000
UV-Vis spectrophotometer	Fisher Scientific	S06497	Nanodrop 2000
pvuII	new England Biolabs	R0151L	restriction enzyme
sfoI	new England Biolabs	R0606L	restriction enzyme
Buffer B	new England Biolabs	B7203S	NEB buffer 3.1
Nuclease free water	Integrated DNA Technologies	11-05-01-14
Capillary electrophoresis	Qiagen	9001941	QIAxcel capillary electrophoresis
Veriti 96-well Fast Thermal Cycler	Thermo Fisher Scientific	4375305	PCR Instrument
Rotating wheel (or Roller)	Eppendorf	M10534004	Cell Culture Roller Drums
DNA size marker	Qiagen	929559	QX size marker (100-2,500 bp)
DNA size marker	Qiagen	929554	QX size marker (50-1,500 bp)
DNA alignment markers	Qiagen	929524	QX DNA Alignment Marker
genomc DNA	Not Available	Not Available	Sample genomc DNA from in vivo or in vitro experiments