Двунаправленная ретровирусная интеграция сайта Методология ПЦР и количественный анализ данных
Summary
В этой рукописи описывается экспериментальная процедура и программный анализ для анализа двунаправленного интеграционного сайта, который может одновременно анализировать ДНК-перекрестный узел вверх и вниз по течению. Двунаправленные продукты ПЦР могут использоваться для любой последующей секвенирующей платформы. Полученные данные полезны для высокопроизводительного количественного сравнения интегрированных целей ДНК.
Abstract
Анализы интеграции (IS) являются критическим компонентом исследования сайтов ретровирусной интеграции и их биологического значения. В недавних исследованиях ретровирусной генной терапии ИСС-анализы в сочетании со последовательностью следующего поколения использовались в качестве инструмента отслеживания клеток для характеристики популяций клоновых стволовых клеток, имеющих один и тот же ИБ. Для точного сравнения репопулирующих клонов стволовых клеток внутри и между разными образцами чувствительность обнаружения, воспроизводимость данных и высокая пропускная способность анализа являются одними из самых важных характеристик анализа. Эта работа обеспечивает подробный рабочий процесс анализа протоколов и данных для двунаправленного анализа ИС. Двунаправленный анализ может одновременно кодировать как переходы, так и нижестоящие узлы-хозяины. По сравнению с обычными однонаправленными подходами секвенирования ИС двунаправленный подход значительно улучшает скорость обнаружения ИБ и характеристику событий интеграции на обоих концах tОн нацеливается на ДНК. Конвейер анализа данных, описанный здесь, точно идентифицирует и перечисляет идентичные последовательности IS посредством нескольких этапов сравнения, которые отображают последовательности IS на эталонный геном и определяют ошибки последовательности. Используя оптимизированную процедуру анализа, мы недавно опубликовали подробные образцы репопуляции тысяч клонов Hematopoietic Stem Cell (HSC) после трансплантации в макаках резуса, впервые демонстрируя точную временную точку репопуляции HSC и функциональную гетерогенность HSCs в Система приматов. В следующем протоколе описывается пошаговая экспериментальная процедура и рабочий процесс анализа данных, который точно идентифицирует и количественно идентифицирует идентичные последовательности IS.
Introduction
Ретровирусы вставляют свою геномную ДНК в геном хозяина в разных местах. Это уникальное свойство, которое может способствовать развитию рака и других форм вирусного патогенеза, имеет ироничную выгоду от того, чтобы эти вирусы были сильно поддаются клеточной инженерии для генной терапии и фундаментальных исследований в области биологии. Вирусный сайт интеграции (IS) – местоположение гена хозяина, в котором интегрирована чужая ДНК (вирус), имеет важные последствия для судьбы как интегрированных вирусов, так и клеток-хозяев. Анализы IS были использованы в различных биологических и клинических исследованиях для изучения селекции и патогенеза сайтов ретровирусной интеграции, развития рака, биологии стволовых клеток и биологии развития 1 , 2 , 3 , 4 . Низкая чувствительность обнаружения, низкая воспроизводимость данных и частое перекрестное загрязнение относятся к числуКлючевые факторы, ограничивающие применение ИСП-анализов для текущих и запланированных исследований.
Разработаны многие технологии анализа IS. Наиболее широко используются анализы сайтов интеграции на основе рестрикционных ферментов, в том числе Linker-Mediated (LM) полимеразная цепная реакция (ПЦР) 5 , обратная ПЦР 6 и ПЦР 7 с линейной амплификацией (LAM). Однако использование сайтов-специфических рестрикционных ферментов создает смещение во время извлечения ИС, позволяя только подмножество интегромов (чужой ДНК, интегрированной в геном хозяина) вблизи рестрикционного сайта, подлежащего восстановлению. 4 . В последние годы также были внедрены аналитические технологии, которые более всесторонне оценивают векторные ИС. Эти анализы используют различные стратегии, в том числе МС-транспозон-опосредованную ПЦР- 8 , нерезистивный (nr) -LAM ПЦР 9 , рестрикционный фермент типа IIПищевое расщепление 10 , механическое срезание 11 и случайную ПЦР (без повторной ПЦР) на основе гексамера 12 , для фрагментации геномных ДНК и амплификации ИС. Современные технологии имеют различные уровни чувствительности обнаружения, охват генома, специфичность мишени, высокую пропускную способность, сложность процедур анализа и предубеждения при определении относительных частот целевых сайтов. Учитывая различные качества существующих анализов и разнообразие целей, для которых они могут быть использованы, следует тщательно подобрать оптимальный подход к анализу.
Эта работа обеспечивает подробные экспериментальные процедуры и рабочий процесс анализа вычислительных данных для двунаправленного анализа, который значительно улучшает скорость обнаружения и точность количественной оценки последовательности, одновременно анализируя ИС вверх и вниз по течению от интегрированной целевой ДНК (см. Рисунок 1 для схематического обзора процедур анализа ). Этот подход также обеспечиваетS – средство для характеристики процесса ретровирусной интеграции (например, верность дублирования целевого сайта и вариации геномных последовательностей восходящих и нисходящих вставок). Другие двунаправленные методы были в основном использованы для клонирования и секвенирования обоих концов ДНК-мишени 11 , 13 , 14 . Этот анализ широко оптимизирован для высокопроизводительной и воспроизводимой количественной оценки векторизованных клонов с использованием хорошо зарекомендовавшего себя метода LM-PCR и картографирования вычислительного анализа, а также для количественного определения обоих восходящих и нисходящих соединений. Двунаправленный анализ с ферментом TaqαI оказался полезным для высокопроизводительной клональной квантификации в доклинических исследованиях генной терапии стволовых клеток 2 , 15 . В этой статье описывается модифицированный метод с использованием более частого резака (RsaI / CviQI – motif: GTAC), который удваивает tОн имеет шансы обнаружить интегромы по сравнению с анализом на основе TaqαI . Описаны подробные процедуры экспериментального анализа и анализа данных, которые используют ферменты мотивации GTAC для лентивирусов (NL4.3 и его производных) и вектора γ-ретровирусных (pMX-векторов). Олигонуклеотиды, используемые в анализе, перечислены в таблице 1 . Внутренний сценарий программирования для анализа последовательности IS представлен в дополнительном документе.
Protocol
Representative Results
Discussion
Двунаправленный анализ позволяет одновременно анализировать как последовательности восходящего (левого), так и нижестоящего (правого) вектора-хозяина ДНК-соединения и полезен в ряде применений генной терапии, стволовых клеток и исследований рака. Использование ферментов GTAC-motif (RsaI и C…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Финансирование осуществлялось Национальными институтами здравоохранения Грантов R00-HL116234, U19 AI117941 и R56 HL126544; Национальный научный фонд Грант DMS-1516675; Национальный исследовательский фонд Кореи (NRF-2011-0030049, NRF-2014M3C9A3064552); И инициатива KRIBB.
Materials
| Thermostable DNA polymerase | Agilent | 600424 | PicoMaxx Polymerase |
| Thermostable DNA polymerase buffer | Agilent | 600424 | PicoMaxx Polymerase buffer |
| Deoxynucleotide (dNTP) solution mix | New England Biolabs | N0447L | dNTP solution mix (10mM each) |
| PCR tubes | VWR International | 53509-304 | PCR Strip Tubes With Individual Attached Caps |
| 2ml microcentrifuge tube | Molecular Bioproducts | 3453 | microcentrifuge tubes |
| PCR purification kit | Qiagen | 28106 | |
| RsaI | New England Biolabs | R0167L | restriction enzyme |
| CviQI | New England Biolabs | R0639L | restriction enzyme |
| Buffer A | New England Biolabs | B7204S | NEB CutSmart buffer |
| DNA Polymerase I large (klenow) fragment | New England Biolabs | M0210L | Blunting |
| streptavidin beads solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
| Binding Solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
| Washing Solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
| magnetic stand | ThermoFisher | 12321D | DynaMag™-2 Magnet |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202L | T4 DNA ligase |
| 10X T4 DNA ligase buffer | New England Biolabs | B0202S | T4 DNA ligase reaction buffer |
| 5X T4 DNA ligase buffer | Invitrogen | 46300-018 | T4 DNA ligase buffer with polyethylene glycol-8000 |
| UV-Vis spectrophotometer | Fisher Scientific | S06497 | Nanodrop 2000 |
| pvuII | new England Biolabs | R0151L | restriction enzyme |
| sfoI | new England Biolabs | R0606L | restriction enzyme |
| Buffer B | new England Biolabs | B7203S | NEB buffer 3.1 |
| Nuclease free water | Integrated DNA Technologies | 11-05-01-14 | |
| Capillary electrophoresis | Qiagen | 9001941 | QIAxcel capillary electrophoresis |
| Veriti 96-well Fast Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | 4375305 | PCR Instrument |
| Rotating wheel (or Roller) | Eppendorf | M10534004 | Cell Culture Roller Drums |
| DNA size marker | Qiagen | 929559 | QX size marker (100-2,500 bp) |
| DNA size marker | Qiagen | 929554 | QX size marker (50-1,500 bp) |
| DNA alignment markers | Qiagen | 929524 | QX DNA Alignment Marker |
| genomc DNA | Not Available | Not Available | Sample genomc DNA from in vivo or in vitro experiments |
References
- Serrao, E., Engelman, A. N. Sites of Retroviral DNA Integration: From Basic Research to Clinical Applications. Crit. Rev. Biochem. Mol. Bio. 51 (1), 26-42 (2016).
- Kim, S., et al. Dynamics of HSPC Repopulation in Nonhuman Primates Revealed by a Decade-Long Clonal-Tracking Study. Cell Stem Cell. 14 (4), 473-485 (2014).
- Bushman, F. Retroviral integration and human gene therapy. J. Clin. Invest. 117 (8), 2083-2086 (2007).
- Bystrykh, L. V., Verovskaya, E., Zwart, E., Broekhuis, M., de Haan, G. Counting stem cells: methodological constraints. Nat Meth. 9 (6), 567-574 (2012).
- Schröder, A., et al. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell. 110 (4), 521-529 (2002).
- Silver, J., Keerikatte, V. Novel use of polymerase chain reaction to amplify cellular DNA adjacent to an integrated provirus. J. Virol. 64, 3150 (1990).
- Schmidt, M., et al. High-resolution insertion-site analysis by linear amplification-mediated PCR (LAM-PCR). Nat. Meth. 4 (12), 1051-1057 (2007).
- Brady, T., et al. A method to sequence and quantify DNA integration for monitoring outcome in gene therapy. Nucleic Acids Res. 39 (11), e72 (2011).
- Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat. Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).
- Kim, S., Kim, Y., Liang, T., Sinsheimer, J., Chow, S. A high-throughput method for cloning and sequencing human immunodeficiency virus type 1 integration sites. J. Virol. 80 (22), 11313-11321 (2006).
- Maldarelli, F., et al. Specific HIV integration sites are linked to clonal expansion and persistence of infected cells. Science. 345 (6193), 179-183 (2014).
- Wu, C., et al. High Efficiency Restriction Enzyme-Free Linear Amplification-Mediated Polymerase Chain Reaction Approach for Tracking Lentiviral Integration Sites Does Not Abrogate Retrieval Bias. Hum. Gene. Ther. 24 (1), 38-47 (2013).
- Aker, M., Tubb, J., Miller, D. G., Stamatoyannopoulos, G., Emery, D. W. Integration Bias of Gammaretrovirus Vectors following Transduction and Growth of Primary Mouse Hematopoietic Progenitor Cells with and without Selection. Mol. Ther. 14 (2), 226-235 (2006).
- Gabriel, R., Kutschera, I., Bartholomae, C. C., von Kalle, C., Schmidt, M. Linear Amplification Mediated PCR; Localization of Genetic Elements and Characterization of Unknown Flanking DNA. J Vis Exp. (88), e51543 (2014).
- Kim, S., et al. High-throughput, sensitive quantification of repopulating hematopoietic stem cell clones. J. Virol. 84 (22), 11771-11780 (2010).
- Mitchell, R., et al. Retroviral DNA integration: ASLV, HIV, and MLV show distinct target site preferences. PLoS Biol. 2 (8), e234 (2004).
- Melkus, M., et al. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nat. Med. 12 (11), 1316-1322 (2006).
- Bystrykh, L. V. A combinatorial approach to the restriction of a mouse genome. BMC Res Notes. 6, 284 (2013).
- Beard, B. C., Adair, J. E., Trobridge, G. D., Kiem, H. -. P. High-throughput genomic mapping of vector integration sites in gene therapy studies. Methods Mol Biol. , 321-344 (2014).
- Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nat. Med. 15 (12), 1431-1436 (2009).
- Qin, X., An, D., Chen, I., Baltimore, D. Inhibiting HIV-1 infection in human T cells by lentiviral-mediated delivery of small interfering RNA against CCR5. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (1), 183-188 (2003).
- Kitamura, T., et al. Retrovirus-mediated gene transfer and expression cloning: powerful tools in functional genomics. Exp. Hematol. 31 (11), 1007-1014 (2003).
- Cartier, N., et al. Hematopoietic stem cell gene therapy with a lentiviral vector in X-linked adrenoleukodystrophy. Science. 326 (5954), 818-823 (2009).
