द्विदिश रेट्रोवायरल इंटीग्रेशन साइट पीसीआर क्रियाविधि और मात्रात्मक डेटा विश्लेषण वर्कफ़्लो
Summary
यह पांडुलिपि एक द्विदिश एकीकरण साइट परख के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रिया और सॉफ्टवेयर विश्लेषण का वर्णन करता है जो एक साथ अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम वेक्टर-होस्ट जंक्शन डीएनए का विश्लेषण कर सकता है। द्वैधिक पीसीआर उत्पादों का उपयोग किसी भी डाउनस्ट्रीम अनुक्रमण मंच के लिए किया जा सकता है। परिणामस्वरूप डेटा उच्च-थ्रुपुट, एकीकृत डीएनए लक्ष्यों की मात्रात्मक तुलना के लिए उपयोगी होते हैं।
Abstract
एकीकरण साइट (आईएस) assays रेट्रोवायरल एकीकरण साइटों के अध्ययन और उनके जैविक महत्व का एक महत्वपूर्ण घटक हैं। हाल के रेट्रोवायरल जीन थेरेपी स्टडीज में आईएस एसेल्स, अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के साथ संयोजन में क्लोनल स्टेम सेल आबादी को उसी आईएस को साझा करने के लिए सेल-ट्रैकिंग उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया गया है। स्टेम सेल क्लोन के भीतर और विभिन्न नमूनों में repopulating सटीक तुलना के लिए, पता लगाने की संवेदनशीलता, डेटा प्रजनन क्षमता, और परख की उच्च-थ्रुपुट क्षमता सबसे महत्वपूर्ण परख गुणों में से हैं। यह काम द्विदिश आईएस विश्लेषण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल और डेटा विश्लेषण कार्यप्रवाह प्रदान करता है। द्विदिश परख एक साथ दोनों अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम वेक्टर-होस्ट जंक्शनों को अनुक्रमित कर सकता है। पारंपरिक यूनिडायरेक्शनल आईएस अनुक्रमण के तरीकों के मुकाबले, द्विदिश दृष्टिकोण में आईएस की पहचान दरों में सुधार और टी के दोनों छोरों पर एकीकरण की घटनाओं की विशेषतावह डीएनए को लक्षित करता है यहां वर्णित डेटा विश्लेषण पाइप लाइन सटीक रूप से पहचान करता है और संदर्भ के कई चरणों के माध्यम से एक समान आईएस श्रृंखला को दर्शाता है जो संदर्भ जीनोम पर आईएस श्रृंखला को मैप करता है और क्रमिक त्रुटियों को निर्धारित करता है। अनुकूलित अनुकूलित प्रक्रिया का उपयोग करते हुए, हमने हाल ही में हजारों हेमटोपोएटिक स्टेम सेल (एचएससी) क्लोनों को रीसस मकाकों में ट्रांसप्लांट के बाद विस्तृत प्रकाशित किया है, जो पहली बार एचएससी रिपॉप्लेशन का सटीक समय बिंदु और एचएससी की कार्यात्मक विविधता को दर्शाता है। प्राइमेट सिस्टम निम्नलिखित प्रोटोकॉल चरण-दर-चरण प्रयोगात्मक प्रक्रिया और डेटा विश्लेषण वर्कफ़्लो का वर्णन करता है जो समान आईएस सीक्वेंस को सही रूप से पहचानता है और मात्रा देता है।
Introduction
रेट्रोवायरस अपने जीनोमिक डीएनए को विभिन्न साइटों पर मेजबान जीनोम में डालें। यह अनूठी संपत्ति, जो कैंसर और वायरल पैथोजेनेसिस के अन्य रूपों के विकास में योगदान दे सकती है, इन वायरस को जीन थेरेपी और मूल जीव विज्ञान अनुसंधान के लिए सेलुलर इंजीनियरिंग के लिए अत्यधिक सक्षम बनाने का विडंबनात्मक लाभ है। वायरल इंटीग्रेशन साइट (आईएस) – होस्ट जीनोम का स्थान जहां एक विदेशी डीएनए (वायरस) एकीकृत है – दोनों एकीकृत वायरस और मेजबान कोशिकाओं के भाग्य के लिए महत्वपूर्ण निहितार्थ हैं। रेट्रोवायरल एकीकरण साइट चयन और रोगजनन, कैंसर विकास, स्टेम कोशिका जीव विज्ञान और विकास जीव विज्ञान 1 , 2 , 3 , 4 का अध्ययन करने के लिए विभिन्न जैविक और नैदानिक अनुसंधान सेटिंग्स में IS assays का उपयोग किया गया है। निम्न पहचान संवेदनशीलता, खराब डेटा प्रतिरूपकता, और लगातार पार-संदूषण शामिल हैंवर्तमान और नियोजित पढ़ाई के लिए आईएस एशेज के आवेदनों को सीमित करने वाले मुख्य कारक
कई IS विश्लेषण तकनीकों को विकसित किया गया है। लिंकर-मध्यस्थता (एलएम) पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) 5 , उलटा पीसीआर 6 , और रैखिक-प्रत्यारोपण-मध्यस्थता (एलएएम) पीसीआर 7 सहित प्रतिबंध एंजाइम-आधारित एकीकरण साइट assays, सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाता है। साइट-विशिष्ट प्रतिबंध एंजाइमों का उपयोग, हालांकि आईएस की पुनर्प्राप्ति के दौरान एक पूर्वाग्रह उत्पन्न करता है, प्रतिबंध साइट के आसपास के क्षेत्र में केवल एक एकीकृत संकाय (एक विदेशी डीएनए जो मेजबान जीनोम में एकीकृत होता है) को अनुमति देता है 4 । हाल ही के वर्षों में वेक्टर तकनीक जो अधिक व्यापक रूप से वेक्टर आईएस का आकलन कर रहे हैं का आकलन किया गया है। ये assays विभिन्न रणनीतियों को रोजगार, जिसमें एमयू ट्रांसपोसन-मध्यस्थता पीसीआर 8 , गैर-पट्टात्मक (एनआर) -एलएम पीसीआर 9 , टाइप-II प्रतिबंध एंजाइम-एमEdiated पाचन 10 , यांत्रिक कर्तन 11 , और यादृच्छिक hexamer- आधारित पीसीआर (पुन: मुक्त पीसीआर) 12 , टुकड़ा जीनोमिक डीएनए करने के लिए और बढ़ाना है वर्तमान प्रौद्योगिकियों में पता लगाने की संवेदनशीलता, जीनोम कवरेज, लक्ष्य विशिष्टता, उच्च-थ्रुपुट क्षमता, परख प्रक्रियाओं की जटिलता, और लक्षित स्थलों के रिश्तेदार आवृत्तियों का पता लगाने में पूर्वाग्रहों के स्तर भिन्न होते हैं। मौजूदा assays के विभिन्न गुणों और विभिन्न प्रयोजनों के लिए जिनके लिए वे उपयोग किया जा सकता है, इष्टतम परख दृष्टिकोण को सावधानी से चुना जाना चाहिए
यह काम विस्तृत प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं और एक द्विदिशा परख के लिए एक कम्प्यूटेशनल डेटा विश्लेषण वर्कफ़्लो प्रदान करता है जो एक साथ एकीकृत रेट डीएनए की आईएस अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम के विश्लेषण के साथ-साथ पहचान दर और अनुक्रम मात्रा का ठहराव सटीकता में सुधार करता है (आवरण प्रक्रियाओं के लिए योजनाबद्ध दृश्य के लिए चित्रा 1 देखें )। यह दृष्टिकोण भी प्रदान करता हैरेट्रोवायरल एकीकरण प्रक्रिया को चिह्नित करने का मतलब है (उदाहरण के लिए, लक्ष्य साइट दोहराव की निष्ठा और अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम प्रविष्टि के जीनोमिक अनुक्रमों में भिन्नता)। लक्ष्यीकरण डीएनए 11 , 13 , 14 के दोनों छोरों के क्लोनिंग और अनुक्रमण के लिए मुख्य रूप से अन्य द्विदिश तरीकों का इस्तेमाल किया गया है। अच्छी तरह से स्थापित एलएम-पीसीआर पद्धति और कम्प्यूटेशनल विश्लेषण मैपिंग का उपयोग करते हुए, और अपस्ट्रीम और डाउनस्ट्रीम जंक्शनों दोनों को बढ़ाए जाने के लिए, इस परख को बड़े पैमाने पर उच्च-थ्रुपुट और वेक्टर-चिह्नित क्लोनों के पुन: उत्पन्न करने योग्य मात्रा के लिए अनुकूलित किया गया है। Taqxii एंजाइम के साथ द्विदिश विश्लेषण स्टेम सेल जीन थेरेपी प्रीक्लिनिनिक अध्ययन 2 , 15 में उच्च-थ्रूपूप क्लोनल मात्रा का ठहराव के लिए उपयोगी साबित हुआ है। यह पत्र एक संशोधित पद्धति का वर्णन करता है जो अधिक बार कटर (आरएआई / सीवीआईयूआई – आकृति: जीटीएसी) का उपयोग करता है जो कि डबल्सवह एक Taqxi- आधारित परख की तुलना में integromes का पता लगाने की संभावना है । लैटिवायरल (एनएल 4.3 और उसके डेरिवेटिव) और गामा-रेट्रोवायरल (पीएमएक्स वैक्टर) वेक्टर आईएस विश्लेषण के लिए जीटीएसी मटेफ एंजाइम का उपयोग करने वाले विस्तृत प्रयोगात्मक और डेटा विश्लेषण प्रक्रियाओं का वर्णन किया गया है। परख में इस्तेमाल किए गए ओलिगोनक्लियोटाइड्स तालिका 1 में सूचीबद्ध हैं। आईएस अनुक्रम विश्लेषण के लिए इन-हाउस प्रोग्रामिंग स्क्रिप्ट पूरक दस्तावेज में उपलब्ध कराई गई है।
Protocol
Representative Results
Discussion
द्विदिश परख दोनों अपस्ट्रीम (बाएं) और डाउनस्ट्रीम (दाएं) वेक्टर-होस्ट डीएनए जंक्शन अनुक्रमों के एक साथ विश्लेषण को सक्षम बनाता है और कई जीन थेरेपी, स्टेम सेल और कैंसर अनुसंधान अनुप्रयोगों में उपयोगी ह?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
अनुदान राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान अनुदान R00-HL116234, U19 AI117941, और R56 एचएल 126544 द्वारा प्रदान किया गया था; राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन ग्रांट डीएमएस -1516675; नेशनल रिसर्च फाउंडेशन ऑफ़ कोरिया (एनआरएफ-2011-0030049, एनआरएफ-2014 एम 3 सी 9 ए 3064552); और केआरआईबी पहल कार्यक्रम।
Materials
| Thermostable DNA polymerase | Agilent | 600424 | PicoMaxx Polymerase |
| Thermostable DNA polymerase buffer | Agilent | 600424 | PicoMaxx Polymerase buffer |
| Deoxynucleotide (dNTP) solution mix | New England Biolabs | N0447L | dNTP solution mix (10mM each) |
| PCR tubes | VWR International | 53509-304 | PCR Strip Tubes With Individual Attached Caps |
| 2ml microcentrifuge tube | Molecular Bioproducts | 3453 | microcentrifuge tubes |
| PCR purification kit | Qiagen | 28106 | |
| RsaI | New England Biolabs | R0167L | restriction enzyme |
| CviQI | New England Biolabs | R0639L | restriction enzyme |
| Buffer A | New England Biolabs | B7204S | NEB CutSmart buffer |
| DNA Polymerase I large (klenow) fragment | New England Biolabs | M0210L | Blunting |
| streptavidin beads solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
| Binding Solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
| Washing Solution | Invitrogen | 60101 | Dynabeads kilobaseBINDER kit |
| magnetic stand | ThermoFisher | 12321D | DynaMag™-2 Magnet |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202L | T4 DNA ligase |
| 10X T4 DNA ligase buffer | New England Biolabs | B0202S | T4 DNA ligase reaction buffer |
| 5X T4 DNA ligase buffer | Invitrogen | 46300-018 | T4 DNA ligase buffer with polyethylene glycol-8000 |
| UV-Vis spectrophotometer | Fisher Scientific | S06497 | Nanodrop 2000 |
| pvuII | new England Biolabs | R0151L | restriction enzyme |
| sfoI | new England Biolabs | R0606L | restriction enzyme |
| Buffer B | new England Biolabs | B7203S | NEB buffer 3.1 |
| Nuclease free water | Integrated DNA Technologies | 11-05-01-14 | |
| Capillary electrophoresis | Qiagen | 9001941 | QIAxcel capillary electrophoresis |
| Veriti 96-well Fast Thermal Cycler | Thermo Fisher Scientific | 4375305 | PCR Instrument |
| Rotating wheel (or Roller) | Eppendorf | M10534004 | Cell Culture Roller Drums |
| DNA size marker | Qiagen | 929559 | QX size marker (100-2,500 bp) |
| DNA size marker | Qiagen | 929554 | QX size marker (50-1,500 bp) |
| DNA alignment markers | Qiagen | 929524 | QX DNA Alignment Marker |
| genomc DNA | Not Available | Not Available | Sample genomc DNA from in vivo or in vitro experiments |
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